Tris緩沖液介紹
Tris-HCl緩沖(chong)液(ye)
注：原文為“龍師兄實驗室”公眾號原創，略有修(xiu)改。
Ver 730464
在生化實(shi)驗中，除(chu)了常(chang)(chang)用(yong)的PB和(he)PBS緩沖(chong)液，還經常(chang)(chang)用(yong)到THB和(he)TBS緩沖(chong)液，那什么是THB和(he)TBS？ THB是Tris-HCl Buffer的縮(suo)寫，中(zhong)文翻譯為“Tris-鹽酸緩(huan)(huan)沖液”，依靠Tris(堿)和HCl(酸)對(dui)溶液起到緩(huan)(huan)沖維持溶液pH值的作用。實驗(yan)室經常稱呼為Tris緩(huan)(huan)沖液或者Tris-HCl緩(huan)(huan)沖液，下文統一稱呼為Tris緩(huan)(huan)沖液。
TBS是Tris Buffered Saline 的簡寫，中文通常稱(cheng)為“三(san)羥甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)氨(an)基(ji)(ji)(ji)甲(jia)(jia)烷緩沖(chong)鹽溶液(ye)”，更準確地譯(yi)名應該是(shi)(shi)“三(san)羥甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)氨(an)基(ji)(ji)(ji)甲(jia)(jia)烷緩沖(chong)生(sheng)(sheng)理鹽水”，是(shi)(shi)生(sheng)(sheng)化實驗廣泛(fan)使(shi)用的一(yi)種緩沖(chong)溶液(ye)。通常是(shi)(shi)在THB的基(ji)(ji)(ji)礎(chu)上加入(ru)(ru)0.9% NaCl（0.15 M），擁有(you)和人體(ti)體(ti)液(ye)類似的滲透(tou)壓(ya)。常用于(yu)清(qing)洗(xi)免疫染色的組織或Western Blotting中的蛋白(bai)印跡膜(mo)等。有(you)時為了滿足其它需(xu)求，需(xu)加入(ru)(ru)Tween-20，這就是(shi)(shi)常用的TBST（TBS with Tween-20）緩沖(chong)液(ye)。
Tris的(de)歷史：
Tris初次引(yin)起廣泛注意的(de)商業成(cheng)功(gong)之(zhi)一是(shi)在魚(yu)的(de)運輸時降低了(le)魚(yu)的(de)死亡率。在20世(shi)紀(ji)40年(nian)代，活魚(yu)是(shi)在盛(sheng)有海水的(de)桶里(li)運往市場的(de)。不幸的(de)是(shi)，許(xu)多魚(yu)因CO2的(de)(de)積(ji)聚使pH下(xia)降(jiang)(jiang)而致(zhi)死(si)。為了(le)解(jie)(jie)決(jue)這個問題，在水(shui)中加入麻醉劑以便使魚(yu)的(de)(de)代謝活動(dong)降(jiang)(jiang)至最低限(xian)度，即使這樣也只能部分地得到緩解(jie)(jie)。1958年(nian)，McFarland和Norris在海水(shui)中加入Tris穩(wen)定其pH，的(de)(de)確(que)降(jiang)(jiang)低了(le)魚(yu)的(de)(de)死(si)亡(wang)率。Tris有(you)很高(gao)的(de)(de)緩沖(chong)能力，在水(shui)中溶解(jie)(jie)度高(gao)，對很多酶反應(ying)是惰性的(de)(de)，Tris也成了(le)用于(yu)許多生化目的(de)(de)非常(chang)滿(man)意的(de)(de)緩沖(chong)液，也是目前用于(yu)分子克隆(long)中大多數酶反應(ying)的(de)(de)標(biao)準緩沖(chong)液。
緩沖(chong)pH范圍:
Tris為弱堿(jian)，在常(chang)溫（25℃）下，它(ta)的(de)(de)pKa為8.1，根據緩沖理論，Tris緩沖液(ye)的(de)(de)有效緩沖范(fan)圍在pH 7.1到9.1之間。0.1 M的(de)(de)水(shui)溶液(ye)pH為10.4，一般加入鹽(yan)酸以調節pH值(zhi)，即(ji)可獲得所需pH值(zhi)的(de)(de)緩沖液(ye)。但同(tong)時應注意溫度對于Tris的(de)(de)pKa的(de)(de)影響對于 Tris 緩沖液(ye)，溫度每降(jiang)低 1℃，pH 增加約(yue)0.03 個單位，濃度每稀(xi)釋 10 倍，pH 降低 0.03-0.05 個(ge)單位。對(dui)于精(jing)確應用(yong)(yong)，使(shi)用(yong)(yong)帶(dai)有玻(bo)璃(li)/甘汞復(fu)合(he)電極的經仔細(xi)校正的 pH 計。
Tris緩沖液(ye)的(de)優點(dian)：
1.Tris為弱堿(jian)，可(ke)以只用一種(zhong)緩沖體系配(pei)制pH范圍(wei)由(you)酸性到堿(jian)性的(de)大范圍(wei)pH值的(de)緩沖液，應用范圍(wei)廣。
2. Tris緩沖(chong)液(ye)對生物(wu)化(hua)學過程干擾很小(xiao)，不與鈣、鎂(mei)離子及重金屬(shu)離子發生沉(chen)淀。
3. Tris在水中(zhong)溶解(jie)度(du)高，對(dui)很多(duo)酶的反應是惰性的。
4. Tris緩沖(chong)能(neng)力(li)高(gao)，在pH7.5-9.0之間(jian)有(you)較(jiao)強的緩沖(chong)能(neng)力(li)。
5. Tris緩沖劑應用(yong)(yong)廣，在生物化(hua)學、分子生物學、體(ti)外診斷、化(hua)妝品、涂料等領域發揮(hui)重(zhong)要作(zuo)用(yong)(yong)。
Tris緩沖液的缺點(dian)：
1.在常(chang)溫（25℃）下，Tris的(de)pKa為8.1；根據緩沖(chong)(chong)(chong)理論，Tris緩沖(chong)(chong)(chong)液的(de)有效緩沖(chong)(chong)(chong)范圍在pH7.1到9.1之間。實際操作中，在pH值小于7.5和大于9.0時，Tris的(de)緩沖(chong)(chong)(chong)能力(li)是非常(chang)低(di)的(de)。
2.Tris緩沖液的pH值受溫度影(ying)響大，△pKa/℃＝-0.031 ，例如：4℃時緩(huan)沖液(ye)的pH=8.4，則37℃時的pH=7.4，所以(yi)一定要(yao)在(zai)使用溫度下進行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩(huan)沖液(ye)不(bu)能用于0-4℃。
3.濃度對Tris解(jie)離有(you)顯著影(ying)響(xiang)。例如，10 mM和100 mM Tris溶液(ye)的(de)pH值會相(xiang)差0.1pH單位，溶液(ye)的(de)濃度越大則其(qi)pH值越高(gao)。
4.Tris作為伯胺，在一定(ding)程度上(shang)與各(ge)種分(fen)子反應，包括(kuo)RNA酶抑(yi)制劑，醛(quan)，酶，DNA以及常見金屬如Cr2+，Fe3+，Ni2+，Co2+和(he)Cu2+等，在有些(xie)系(xi)統(tong)中(zhong)(zhong)會起抑制作用，在配(pei)制過程中(zhong)(zhong)需考慮與(yu)其他(ta)組(zu)分(fen)之(zhi)間(jian)的相互作用。
5. Tris緩沖液易(yi)吸收空氣中的CO2，配制的(de)緩沖(chong)液要注意蓋(gai)嚴密封。
6. Tris與許(xu)多類型含有亞麻纖維接(jie)頭的pH電(dian)極起反應，這種影(ying)響表現(xian)在(zai)電(dian)動勢(emf)漂移，平衡時間加(jia)長。因此，具(ju)有亞麻纖維接(jie)頭的電(dian)極不能(neng)精確測定Tris溶(rong)液的pH值(zhi)。只能(neng)使用具(ju)有陶瓷或(huo)玻璃接(jie)頭的電(dian)極測定Tris溶(rong)液的pH值(zhi)。
7. Tris對(dui)許多哺乳動(dong)物(wu)有毒性。吸入、攝入、皮膚吸收(shou)Tris可造成傷害，操(cao)作時需(xu)戴好手套和護目鏡(jing)；
8. 作(zuo)為蛋白緩(huan)沖液時，若后續工作(zuo)需要質譜(pu)，則不適宜用Tris，需換成其他質譜(pu)儀(yi)可耐(nai)受的緩(huan)沖液。
各種與Tris相關(guan)緩沖液的配制方法:
一、1×TBS的配制
1× TBS ( pH7.4 ) 的配(pei)制（0.02 M Tris，0.15 M NaCl，pH7.4）：2.4 g Tris ( 三羥(qian)甲基胺基甲烷(wan) )，8.76 g NaCl ，950 ml超(chao)純水(shui)， 磁力攪拌下滴加濃HCl至pH為7.4，再加超(chao)純水(shui)定容至1000 ml，即可。如需(xu)含0.1% Tween-20，則在(zai)滴加HCl前先(xian)加入1ml Tween-20。
二、THB的(de)配制
Tris-HCl緩沖液的(de)兩種配置方法：
第一種方法是用Tris-HCl粉(fen)末(mo)（MW 157.6）和Tris粉(fen)末(mo)（MW 121.14）按照不(bu)同(tong)比例混合，用水溶解(jie)即配成不(bu)同(tong)pH的Tris-HCl緩沖液(ye)。
另(ling)外(wai)一種方法是只用Tris粉末，用鹽酸調節(jie)需(xu)(xu)要的pH值(zhi)：以配置1 L 0.1 M的Tris-HCl緩沖液(ye)為例：先稱(cheng)12.11 g Tris堿溶于950 mL超純水(shui)中(zhong)，邊攪拌邊滴加(jia)(jia)濃(nong)鹽酸，用pH計測(ce)定溶液(ye)所需(xu)(xu)的pH值(zhi)，然(ran)后(hou)再加(jia)(jia)水(shui)補足到1 L即可。
配(pei)制(zhi)50 mM Tris-HCl緩沖液 1升配(pei)制(zhi)方法：
溫度對 50 mM Tris-HCl液(ye)pH值(zhi)的影(ying)響(xiang)
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4℃
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25℃
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37℃
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8.1
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7.5
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7.2
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8.2
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7.6
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7.3
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8.3
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7.7
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7.4
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8.4
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7.8
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7.5
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8.5
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7.9
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7.6
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8.6
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8.0
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7.7
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8.7
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8.1
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7.8
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8.8
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8.2
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7.9
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8.9
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8.3
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8.0
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三、TBST緩沖液(ye)
TBST是TBS + Tween的(de)縮寫，含(han)有(you)(you)Tris-HCl，NaCl，Tween-20，是做(zuo)Western Blot常用(yong)的(de)一種洗膜緩沖液(ye)，1×TBST濃度為0.02 M Tris，0.15 M NaCl，0.1% Tween-20，pH7.4。WB實驗中，為了防止曝光圖背景太高，在孵育(yu)時，混有(you)(you)Tween 的(de)TBST 能洗掉PVDF膜上(shang)非特異性吸(xi)附的(de)蛋白(bai)質。Tween是一種離子表面活性劑，有(you)(you)復性抗原作用(yong)，可提高抗體特異性結合。TBST緩沖液(ye)于室溫儲存(cun)，若溫度過低，會(hui)產生(sheng)沉淀，可溶解或加熱后使用(yong)。
四、TE緩(huan)沖(chong)液
TE緩沖(chong)液(ye)是Tris-HCl緩沖(chong)液(ye) + EDTA，1×TE濃度為(wei)10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA pH8.0。為(wei)使用方便，TE緩沖(chong)液(ye)也可以配(pei)成(cheng)10×或(huo)50×濃度。TE緩沖(chong)液(ye)是弱堿(jian)性(xing)(xing)，對DNA的堿(jian)基有保護作用，因(yin)此，DNA在TE中的穩(wen)定性(xing)(xing)較好，不易被破壞完整性(xing)(xing)或(huo)產生開環及斷(duan)裂，TE緩沖(chong)液(ye)被用于DNA的穩(wen)定和(he)儲存。
五、TAE緩沖液
TAE緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)液(ye)是(shi)(shi)(shi)將TE緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)液(ye)中的(de)(de)鹽酸換成乙酸（Tris/Acetate/EDTA），50×TAE濃度為2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA，~pH8.5。TAE是(shi)(shi)(shi)使用(yong)最廣泛的(de)(de)緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)系統。其特點是(shi)(shi)(shi)超螺旋電泳時(shi)更(geng)符合實際(ji)相對分子質量，且雙鏈線狀DNA在其中的(de)(de)遷(qian)移率較快，電泳大于(yu)13 kb的(de)(de)片(pian)段時(shi)用(yong)TAE緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)液(ye)將取得更(geng)好的(de)(de)分離效果，此(ci)外，回收DNA片(pian)段時(shi)也建議用(yong)TAE緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)系統進行電泳。但是(shi)(shi)(shi)，TAE的(de)(de)缺點是(shi)(shi)(shi)緩(huan)(huan)(huan)沖(chong)容量弱，長(chang)時(shi)間電泳不建議使用(yong)。
六、TBE緩(huan)沖液
TBE緩沖(chong)液是將TE緩沖(chong)液中的鹽(yan)酸換成硼(peng)酸（Tris/Borate/EDTA），5×TBE濃(nong)度為445 mM Tris-硼(peng)酸，10 mM EDTA，~pH8.3。TBE緩沖(chong)液常用(yong)于丙(bing)烯酰(xian)胺電泳(yong)(yong)以(yi)及瓊脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)(yong)。TBE可用(yong)于長時(shi)間電泳(yong)(yong)，對(dui)較(jiao)小片段分離(li)效果(guo)較(jiao)好。但是，超螺旋在TBE緩沖(chong)液中電泳(yong)(yong)時(shi)測出(chu)的相對(dui)分子質量(liang)會(hui)稍(shao)大(da)于實際分子質量(liang)。另外，有文獻報道，硼(peng)酸會(hui)影響DNA的連接，如果(guo)要(yao)進行凝膠(jiao)回收的話，盡(jin)量(liang)不(bu)使(shi)用(yong)TBE緩沖(chong)液。