超濾離心管的使用
注：本(ben)文引自“分(fen)子(zi)莊園”公眾號，略有修改(gai)。
超濾(lv)離心管是一種(zhong)膜(mo)(mo)過(guo)濾(lv)設(she)備，是用于分離液體中(zhong)不同(tong)分子或(huo)粒子的裝置。它利用特殊的超濾(lv)膜(mo)(mo)，通(tong)過(guo)應用壓力將液體樣(yang)品(pin)推動穿過(guo)膜(mo)(mo)，從而分離不同(tong)分子或(huo)粒子的大小，廣泛(fan)用于蛋白質、DNA和生(sheng)物分子的濃縮、純化和脫鹽。
一、超濾與微(wei)濾
1、微濾
微(wei)濾(lv) (Microfiltration) 涉(she)及(ji)利用微(wei)孔膜介(jie)質(zhi)去除(chu)溶液(ye)中尺寸(cun)為(wei) 0.1 μm 至(zhi) 10.0 μm 的(de)顆(ke)粒或(huo)生物體。而超(chao)濾(lv)膜的(de)過濾(lv)范圍為(wei)0.01μm至(zhi)0.1μm。
微(wei)(wei)濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)廣泛(fan)應(ying)用于生物制藥行業中的(de)預(yu)過濾(lv)(lv)(lv)和(he)除菌(jun)過濾(lv)(lv)(lv)。 在細胞實(shi)驗(yan)中，微(wei)(wei)濾(lv)(lv)(lv)最常用于樣品(pin)和(he)培養基(ji)的(de)滅菌(jun)（0.1μm微(wei)(wei)濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)可(ke)去除支原體）。
此(ci)(ci)外，在(zai)核酸(suan)和蛋(dan)白質分(fen)析之前(qian)，使(shi)用(yong)微濾膜可以(yi)有效地從細胞裂解物中去除(chu)完整的(de)(de)(de)細胞和細胞碎片。 此(ci)(ci)步驟對(dui)于(yu)確保下游應(ying)用(yong)中結果的(de)(de)(de)準(zhun)確性至關重(zhong)要。 通過微濾，研(yan)究人(ren)員可以(yi)獲(huo)得純化的(de)(de)(de)樣品(pin)，從而提高核酸(suan)和蛋(dan)白質相關研(yan)究的(de)(de)(de)靈敏(min)度和特異性。
2、超濾
超(chao)濾 (Ultrafiltration) 也(ye)是一種(zhong)膜(mo)過(guo)(guo)濾，通過(guo)(guo)壓力或(huo)濃度(du)梯度(du)等(deng)力使料液通過(guo)(guo)半透膜(mo)進行分(fen)離(li)。 超(chao)濾膜(mo)能夠截留尺寸范圍為1-1000kDa（MW）的分(fen)子(zi)，并允許鹽(yan)和水(shui)等(deng)小分(fen)子(zi)通過(guo)(guo)。
超濾是大分子脫(tuo)鹽、濃(nong)縮最方便的方法(fa)，已經在蛋白、抗體、病(bing)毒、核酸、囊(nang)泡等樣品制(zhi)備中(zhong)建立標(biao)準(zhun)操作。與沉(chen)淀法(fa)相比，超濾法(fa)更(geng)為溫和(he)，避免了可能導致生物大分子失活的(de)相變(bian)。
二、死端過(guo)濾(lv)和切向流過(guo)濾(lv)水流的(de)方向垂直于(yu)膜(mo)(mo)的(de)表面，能最大限度的(de)提高水通(tong)量(liang)，在(zai)壓力(li)差的(de)作用下(xia)，水和(he)小(xiao)于(yu)膜(mo)(mo)孔的(de)顆粒或(huo)物質(zhi)透過(guo)膜(mo)(mo)，大于(yu)膜(mo)(mo)孔的(de)顆粒則被(bei)膜(mo)(mo)截留。死端過(guo)濾(lv)隨著過(guo)濾(lv)時間(jian)的(de)延長，被(bei)截留顆粒將在(zai)膜(mo)(mo)表面形成污染層，阻(zu)塞膜(mo)(mo)孔，使(shi)過(guo)濾(lv)阻(zu)力(li)增加(jia)，在(zai)操作壓力(li)不變的(de)情(qing)況下(xia)，膜(mo)(mo)的(de)過(guo)濾(lv)透過(guo)率將下(xia)降；而增加(jia)壓力(li)則可能是膜(mo)(mo)破裂。因此，死端過(guo)濾(lv)只能間(jian)歇進行，必須(xu)周期性地(di)清除(chu)膜(mo)(mo)表面的(de)污染物層或(huo)更換膜(mo)(mo)。又叫錯流過濾(lv)（cross flow filtration）：水流的(de)方向平(ping)行(xing)于膜的(de)表面，可以(yi)大(da)量(liang)減少污染物在表面的(de)富集，因為水流會將其帶走，同時也(ye)減少了堵孔的(de)概率，使(shi)膜的(de)通(tong)量(liang)能夠保持，同時，膜上面承受的(de)壓力也(ye)更小(xiao)，可以(yi)延長膜的(de)使(shi)用壽命。錯流過濾(lv)(lv)運(yun)行(xing)時，水流在膜(mo)表面(mian)產生兩個分力，一個是垂直于膜(mo)面(mian)的(de)法向力，使水分子(zi)透過膜(mo)面(mian)，另一種是平(ping)行(xing)于膜(mo)面(mian)的(de)切向力，把膜(mo)面(mian)的(de)截留物(wu)沖刷掉。因此，錯流過濾(lv)(lv)的(de)濾(lv)(lv)膜(mo)表面(mian)不易(yi)產生濃差極(ji)化現象和結垢問(wen)題，過濾(lv)(lv)透過率衰減較(jiao)慢。錯流過濾(lv)(lv)的(de)運(yun)行(xing)方式比較(jiao)靈活(huo)，既(ji)可以(yi)間歇運(yun)行(xing)，又可以(yi)實現連續運(yun)行(xing)。
三(san)、超濾(lv)離心管(guan)
超濾離心(xin)管是一種利用離心(xin)力驅動中小體積溶液(ye)通過超濾膜，進行快速濃縮、滲濾和緩沖液(ye)置換的(de)裝置。 它(ta)由蓋子、過濾裝置和離心(xin)管組成。
中間的過濾裝置既可(ke)用于滲透樣(yang)品，也可(ke)以用于保留(liu)樣(yang)品。當目(mu)標分子明顯小(xiao)于濾膜孔徑(jing)時，可使用超濾離心管(guan)對(dui)大分子污染物進行除熱源、澄清和分離。目(mu)標樣品(pin)會透過濾膜并保留在離心管(guan)內。如果目標(biao)分子遠大于膜孔徑，則小分子污染(ran)物將被濾除，目標(biao)分子將集中(zhong)在過濾裝(zhuang)置中(zhong)。垂(chui)直設計的(de)超濾膜具有(you)更大的(de)有(you)效(xiao)濾膜表面積，有(you)助于快速的(de)樣本處(chu)理，獲得較高的(de)樣本回收率（通常>90%），并達到數十(shi)倍(bei)的(de)濃縮(suo)，同時也最大程度(du)降低了大顆粒或大分子量物(wu)質堵(du)塞(sai)濾膜。死體(ti)積設計能有效防止過度(du)離心使樣本干(gan)掉而造成(cheng)樣本損失(shi)。
收集濾出液后，濃縮樣本（截留部分(fen)）可通(tong)過一個簡便(bian)的倒置（上下(xia)反轉）離心步驟而實現(xian)高效回收。反轉(zhuan)離心回收設計使蛋(dan)白樣(yang)(yang)品(pin)，特別是小(xiao)體積樣(yang)(yang)品(pin)得到高效(xiao)回收，避免槍頭(tou)吸取造(zao)成的樣(yang)(yang)品(pin)丟失(shi)或操作錯(cuo)誤。
超(chao)濾管采用切向流(liu)過(guo)濾技術(shu)，是一種以篩分(fen)為分(fen)離原理，以壓力(li)為推動力(li)的膜(mo)分(fen)離過(guo)程。用于截(jie)留水(shui)中(zhong)顆(ke)粒和大(da)分(fen)子物(wu)(wu)質，而水(shui)和小分(fen)子物(wu)(wu)質則允許透過(guo)膜(mo)，過(guo)濾精度在0.001-0.01μm（分(fen)子量1kD-1000kD）范圍內，可有效除去有機溶劑或者小分(fen)子物(wu)(wu)質，相(xiang)反(fan)，也可以截(jie)留水(shui)中(zhong)的微粒、膠體、細(xi)菌、熱源及(ji)高(gao)分(fen)子聚合物(wu)(wu)。選擇超(chao)濾離心管需要考慮樣品起始量以(yi)及超(chao)濾膜的截留(liu)分子量(MWCO)。影響截(jie)留和產物回收率(lv)的(de)(de)因素有(you)很多(duo)，如分(fen)子構象(xiang)、帶電特性、樣品濃度(du)、操作條(tiao)件等。而(er)且超濾管上的(de)(de)截(jie)留分(fen)子量只是(shi)平均孔徑，實際孔徑是(shi)在左右正太分(fen)布的(de)(de)。
一般(ban)建議選擇截留分(fen)子量要比(bi)要濃縮的目標大(da)分(fen)子的分(fen)子量小2-3倍的超(chao)濾膜，然后根據要處理(li)的樣(yang)品體積選擇不同尺寸的超濾離心管。
4、超(chao)濾離(li)心管(guan)的預處理(li)為防超(chao)濾膜干裂和(he)長菌，通常(chang)超(chao)濾離心管內會(hui)附帶少量甘油和(he)疊氮化鈉用于保護和(he)儲存(cun)，在使用前需潤洗去除。一般是向(xiang)超濾裝(zhuang)置(zhi)中(zhong)加(jia)入純(chun)水(shui)、去(qu)離子水(shui)或緩沖溶液，離心使溶液完全過膜，然后離心管中的所有液體。如(ru)果干擾(rao)仍(reng)然存(cun)在，可用(yong)0.1 M NaOH清(qing)洗(xi)(xi)，再用(yong)20％的乙醇清(qing)洗(xi)(xi)，最后用(yong)緩沖液或超(chao)純(chun)水水清(qing)洗(xi)(xi)并甩干。超濾膜一旦潤(run)濕(shi)后就需保持濕(shi)潤(run)避免變干直至使用結束，如(ru)果預清洗后沒(mei)有立即使用，可用20％的乙醇(chun)浸泡保存，務必保持濾膜潤(run)濕(shi)，防止長(chang)菌(jun)。
5、超濾管(guan)的放置
超濾(lv)(lv)管在離心機(ji)中的(de)擺放需要(yao)符(fu)合(he)切向流(liu)過(guo)濾(lv)(lv)要(yao)求，即(ji)水(shui)流(liu)方向與膜面平行(xing)。
1）水平轉子(zi)
使(shi)用水(shui)平轉子時放置沒有特(te)殊要求。
水平轉子又(you)稱甩(shuai)平(ping)(ping)(ping)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)子(zi)、蕩平(ping)(ping)(ping)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)子(zi)，轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)頭(tou)(tou)靜止時(shi)(shi)，處(chu)于(yu)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)頭(tou)(tou)中(zhong)的離(li)(li)(li)(li)心(xin)管中(zhong)心(xin)線與(yu)旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)軸(zhou)平(ping)(ping)(ping)行，轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)頭(tou)(tou)旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)加(jia)速時(shi)(shi)，離(li)(li)(li)(li)心(xin)管中(zhong)心(xin)線由平(ping)(ping)(ping)行位(wei)置逐漸(jian)過渡到垂直位(wei)置，即與(yu)旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)軸(zhou)成90?角。此種轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)子(zi)主要用于(yu)樣品做密度(du)梯度(du)離(li)(li)(li)(li)心(xin)，顆粒(li)移動距(ju)離(li)(li)(li)(li)長(chang)，相(xiang)應離(li)(li)(li)(li)心(xin)時(shi)(shi)間一般也較長(chang)，溶液中(zhong)的組分(fen)相(xiang)對(dui)于(yu)管壁的位(wei)置在離(li)(li)(li)(li)心(xin)過程中(zhong)和離(li)(li)(li)(li)心(xin)后不發生改變(bian)，因此離(li)(li)(li)(li)心(xin)效果好(hao)，能夠分(fen)離(li)(li)(li)(li)密度(du)差小的樣品。
2）固定角轉子
使用角(jiao)轉子(zi)時，雙(shuang)面垂直(zhi)膜(mo)超濾管放(fang)置方式要求(qiu)濾膜(mo)側(ce)向(xiang)相(xiang)對。
單面(mian)垂直(zhi)膜(mo)要求濾(lv)(lv)膜(mo)膜(mo)面(mian)朝下，這樣(yang)濾(lv)(lv)膜(mo)才(cai)能發(fa)揮切向(xiang)流的作用。
有尖(jian)角(jiao)的超濾管應使尖(jian)角(jiao)朝上以便(bian)樣品(pin)(pin)進入尖(jian)角(jiao)，讓(rang)樣品(pin)(pin)收集(ji)更加方便(bian)，此(ci)外，死體積設計能有效防止過度離心(xin)使樣本干掉而造成樣本損失。固定角轉子中離(li)心(xin)管與轉(zhuan)子的轉(zhuan)軸(zhou)之間有一定的角度，角度變(bian)化范圍通常在14?-45?。此種轉(zhuan)子重心(xin)低，壽命(ming)長(chang)，容量較(jiao)大，轉(zhuan)速(su)較(jiao)高(gao)，能(neng)承(cheng)受的最大離(li)心(xin)力(li)可達800000g，主要用于分離(li)沉(chen)降(jiang)速(su)度有明(ming)顯差異的顆粒樣品。顆粒在扇形(xing)溶(rong)液移動的距離(li)很(hen)短(duan)，碰(peng)到外壁(bi)的顆粒沿著管壁(bi)滑到管底，形(xing)成沉(chen)淀，因此這種轉(zhuan)子能(neng)很(hen)快地收集沉(chen)淀物。
6、超(chao)濾管(guan)的(de)截留(liu)分子量和膜(mo)孔(kong)徑關系(xi)
超(chao)濾管是(shi)一(yi)種膜過(guo)濾設備(bei)，用于分(fen)(fen)(fen)離液體(ti)中(zhong)不同(tong)分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)或粒子(zi)(zi)的裝置。它利用特殊(shu)的超(chao)濾膜，通過(guo)應用壓(ya)力(li)將液體(ti)樣品推動穿過(guo)膜，從(cong)而分(fen)(fen)(fen)離不同(tong)分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)或粒子(zi)(zi)的大(da)小。這種分(fen)(fen)(fen)離過(guo)程基于分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)截(jie)(jie)留量，也就(jiu)是(shi)膜的孔(kong)徑大(da)小，決定了哪(na)些分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)可以通過(guo)膜，哪(na)些分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)被截(jie)(jie)留在膜上(shang)。
分(fen)(fen)子截留量是表(biao)(biao)示超濾膜(mo)(mo)的選擇性的重要參數，通常以道爾頓（Da）為單(dan)位，分(fen)(fen)子截留率表(biao)(biao)示膜(mo)(mo)可(ke)以截留的最大分(fen)(fen)子或(huo)粒子的大小。具體來(lai)說，如(ru)果膜(mo)(mo)的分(fen)(fen)子截留率是10kD，則該(gai)膜(mo)(mo)能夠截留分(fen)(fen)子量小于(yu)(yu)或(huo)等于(yu)(yu)10000的分(fen)(fen)子，而分(fen)(fen)子量大于(yu)(yu)10000的分(fen)(fen)子將被截留在膜(mo)(mo)上。
道(dao)爾頓是用來表(biao)示分(fen)子質(zhi)量(liang)(liang)或原子質(zhi)量(liang)(liang)的單(dan)位，一個分(fen)子的道(dao)爾頓數值大(da)約等于其相(xiang)對(dui)原子質(zhi)量(liang)(liang)或相(xiang)對(dui)分(fen)子質(zhi)量(liang)(liang)。
截留(liu)分(fen)子(zi)量(liang)和孔徑之間的(de)(de)(de)關系是復雜的(de)(de)(de)。通(tong)(tong)常超濾膜的(de)(de)(de)截留(liu)分(fen)子(zi)量(liang)是指在一定條件下(xia),某(mou)些分(fen)子(zi)量(liang)的(de)(de)(de)物(wu)質(zhi)被(bei)膜截留(liu)，被(bei)截住物(wu)質(zhi)的(de)(de)(de)最小分(fen)子(zi)量(liang)即為(wei)膜的(de)(de)(de)截留(liu)分(fen)子(zi)量(liang)，用(yong)以表征膜的(de)(de)(de)分(fen)離能力；而孔徑則是反映(ying)膜的(de)(de)(de)通(tong)(tong)透性的(de)(de)(de)重要參(can)數(shu)。分(fen)子(zi)量(liang)通(tong)(tong)常用(yong)單(dan)位為(wei)Dalton(Da)表示，而孔徑大小通(tong)(tong)常用(yong)單(dan)位為(wei)納米(nm)表示。
超濾膜截留的分子(zi)量(liang)10000、30000、50000 60000、100000、200000、300000、500000、1000000，對應超濾膜孔徑(μm) 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1。也就是說100kd（10萬）的截留分子(zi)量(liang)對應50nm的孔徑。
從數據上看,似乎存(cun)在一種(zhong)對(dui)應關(guan)系(xi)(xi)，如(ru)超(chao)濾(lv)膜(mo)截留(liu)分(fen)子量為(wei)100kD（10萬）時,對(dui)應的(de)(de)孔(kong)(kong)徑(jing)為(wei)0.05μm。但這種(zhong)關(guan)系(xi)(xi)并(bing)不(bu)完全準確。因為(wei)超(chao)濾(lv)膜(mo)的(de)(de)孔(kong)(kong)徑(jing)和分(fen)子量的(de)(de)關(guan)聯并(bing)非簡單(dan)的(de)(de)線性關(guan)系(xi)(xi)，對(dui)于具體的(de)(de)過濾(lv)器或分(fen)離膜(mo)，其(qi)材料、制備(bei)方(fang)法、孔(kong)(kong)徑(jing)大小分(fen)布等因素都會(hui)影響它們之間的(de)(de)關(guan)系(xi)(xi)。
7、超濾(lv)管的離心
超濾管(guan)如果離(li)心(xin)轉速(su)過高，可能會導致(zhi)膜(mo)甚至管(guan)子的破裂，做實驗時要根據不同品牌(pai)超濾管(guan)的說明書中明確(que)指(zhi)出的最(zui)大轉速(su)和離(li)心(xin)力(li)，調整離(li)心(xin)轉速(su)到(dao)超濾管(guan)的承受范圍內。
離心機(ji)的轉(zhuan)速與離心機(ji)的半(ban)徑以(yi)及離心力都有關系(xi)，不同半(ban)徑的離心機(ji)，相同轉(zhuan)速出來的離心力也不一樣。離心力g和rpm（轉／min）轉換公式：g=r×11.8×10??×rpm2，其中g有時用相對離心力（RCF）表(biao)示。
r 為有(you)效(xiao)離心半徑(jing)，即從離心機(ji)軸心到離心管底的長度，單位為厘米（cm）。
8、超濾管使用建(jian)議
1）超濾(lv)管不能進行高壓滅菌，可使(shi)用70%乙醇或環(huan)氧乙烷滅菌。
2）超濾管一般(ban)不建(jian)議重復使(shi)用超過5次。受到樣品性(xing)質的影響，先用0.1M的NaOH浸泡1-2h，然后用20%乙(yi)醇清洗，最后用超純水或緩沖液(ye)清洗3次，即可再用。
3、如果樣品(pin)是線性蛋白，需使用較低的離心速度和(he)時間避免(mian)蛋白降解(jie)。
4、濃(nong)縮過(guo)快(kuai)或(huo)者(zhe)過(guo)度(du)濃(nong)縮可能(neng)會引(yin)起蛋白(bai)沉淀。建議蛋白(bai)濃(nong)縮后最終濃(nong)度(du)不超(chao)過(guo)20mg/ml，同(tong)時(shi)降低離心速度(du)并改用(yong)截留分(fen)子量(liang)更大的超(chao)濾管。
建議的(de)改進方法是(shi)：①離(li)心(xin)力降為推薦離(li)心(xin)力的(de)30%-50%；②改用(yong)截留分子量(liang)大的(de)超濾管(如原(yuan)本選(xuan)用(yong)10kD，此時可以選(xuan)擇30kD)；③取出超濾管, 用(yong)吸(xi)頭反復吹吸(xi)幾次后再繼續濃縮。
6、過(guo)濾速(su)率(lv)受(shou)到超濾管MWCO，樣品濃度(du)，粘度(du)，離心(xin)力和溫度(du)的影響。如(ru)果樣品中固體含(han)量超過(guo)5%，離心(xin)時間需要增加(jia)。當在4℃下運行(xing)時，流速(su)大(da)約比25℃時慢(man)1.5倍(bei)。粘性溶液(ye)(如(ru)50%甘油)的濃縮時間大(da)概是常(chang)規溶液(ye)的5倍(bei)。
7、如(ru)果要(yao)用超濾(lv)的(de)方法分(fen)離兩種蛋白，按照經驗(yan)，兩個(ge)蛋白的(de)分(fen)子量要(yao)相差一(yi)個(ge)數(shu)量級（10 倍）。
8、擔心濃縮過(guo)程中目(mu)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)和超(chao)濾膜(mo)之間可能存在非(fei)特異性吸(xi)附(fu)，可嘗試以(yi)下操(cao)作：①確保蛋白(bai)(bai)濃度不(bu)要(yao)過(guo)低；②盡(jin)量選用(yong)(yong)纖維素(su)的(de)(de)低吸(xi)附(fu)超(chao)濾；③選用(yong)(yong)小體積超(chao)濾管，通(tong)過(guo)減小膜(mo)面積來降低非(fei)特異性吸(xi)附(fu)；④使用(yong)(yong)前可以(yi)先對膜(mo)進(jin)行封閉(bi)：1%脫(tuo)脂(zhi)奶(nai)粉，1%BSA，5%Tween 20，5%SDS，5%TritonX-100，5%PEG3000（不(bu)影(ying)響蛋白(bai)(bai)活性，不(bu)影(ying)響蛋白(bai)(bai)后續使用(yong)(yong)的(de)(de)前提下）。
9、對(dui)于有些樣品含量(liang)(liang)非常少的(de)情況，可嘗試一(yi)下操作：①盡量(liang)(liang)選擇較(jiao)小(xiao)的(de)截留分子(zi)量(liang)(liang)的(de)超濾管(guan)；②選擇帶有尖角收(shou)集(ji)器(qi)的(de)超濾管(guan)以便最大限度回(hui)收(shou)樣品；③使用(yong)水平(ping)轉子(zi)優(you)于角轉子(zi)；④濃縮完用(yong)緩(huan)沖(chong)液清洗多(duo)次(ci)回(hui)收(shou), 注(zhu)意移液器(qi)的(de)槍頭不要碰到(dao)膜，以免(mian)膜破裂；⑤使用(yong)前可以先對(dui)膜進行封閉。