瓊脂(zhi)糖凝膠電泳后(hou)的 DNA 條帶異常現象(xiang)
 

你是(shi)否在 DNA 電(dian)泳后遇到過這(zhe)種現象(xiang)呢？
 

DNA Marker 或樣(yang)品的(de)某些條(tiao)帶(dai)呈笑臉型、W 型、亮度異常，多條(tiao)條(tiao)帶(dai)堆疊(die)在一起、無法區分(fen)開，或者出現拖(tuo)尾現象
 

這些都會影響 Marker 的功能，使樣品的條帶大小和濃度難以準確預估

技術背景

核酸電泳是進行核酸研究的重要手段，是核酸探針、核酸擴增和序列分析等技術所不可或缺的組成部分。
 

溴化乙錠（EB）由于價格便宜，常用于瓊脂糖和 PAGE 凝膠中的核酸染色。但 EB 是強致癌誘變劑，由于其分子量較小，極易滲透細胞膜與胞內 DNA 分子嵌合，進而影響 DNA 的復制，破壞正常的遺傳生理現象。
 

鑒于此，很多廠家研發了大分子的新型核酸染料，新型核酸染料由于分子較大，更難進入細胞，所以安全性更高。而且靈敏度更高，比如 GelRed 大約是 EB 的 4～5 倍。
 

EB 與 GelRed 靈敏度對(dui)比

但也正是新型染料分(fen)子較大，會影響(xiang) DNA 分(fen)子在電(dian)(dian)泳時的遷(qian)移，所以 DNA 條帶在電(dian)(dian)泳中可能發生扭(niu)曲、變形、拖尾現象。
 

核酸染料結合 DNA 后改變了 DNA 的空間結構，使原本帶負電荷的電量減少，DNA 分子增大。
 

這(zhe)一系列改(gai)變(bian)使得 DNA 分(fen)子在(zai)瓊脂糖凝膠電泳(yong)中的(de)相互作用(yong)力改(gai)變(bian)，運動(dong)特點(dian)和(he)未結合(he)核酸染料的(de) DNA 分(fen)子也有所不同，這(zhe)些因(yin)素共同導致(zhi) DNA 分(fen)子的(de)形態在(zai)運動(dong)中發生了改(gai)變(bian)。特別是(shi)對大分(fen)子量的(de) Marker，可能導致(zhi) Marker 條帶(dai)變(bian)形、分(fen)不開的(de)現象。
 

根據核酸染色和電泳的先后順序，核酸電泳一般可分為預染法（前染法）和泡染法（后染法）兩種方法, 在凝膠中添加染料稱為預染法，電泳完成之后再進行染色稱為泡染法。

我們實(shi)驗中經(jing)常用到的(de)(de)就是(shi)預(yu)染法，但(dan)預(yu)染法在電(dian)泳中可(ke)能遇到上(shang)述的(de)(de)一些問題，而由于泡(pao)染法是(shi)電(dian)泳后再染色，可(ke)有(you)效(xiao)避免上(shang)述現象(xiang)的(de)(de)產生。
 

實(shi)驗(yan)案例

下面，以我們東盛生物的新型核酸染料 DSRed（貨號：M7021）和 22 種 DNA Marker 為實驗材料，做一個預染法與泡染法中核酸染料對ＤＮＡ條帶形態影響的驗證：

我們(men)選擇了(le)(le)不同大小的 Marker 并(bing)對其分(fen)類，分(fen)別用(yong) 1%、1.7%、3% 濃度的凝膠進行(xing)了(le)(le)預染法和泡染法電泳對比(bi)。

以下(xia)左(zuo)圖為預(yu)染(ran)結(jie)果(guo)，右圖為泡(pao)染(ran)結(jie)果(guo)：
 

Figure.1 適合 1% 凝(ning)膠濃度的 DNA Marker（大片段較多）的預(yu)染(ran)/泡染(ran)對比（1） 

Figure.2 適(shi)合(he) 1% 凝膠濃度的 DNA Marker（大片段較多）的預染/泡染對比（2）

Figure.3 適合(he) 1.7% 凝膠濃度的 DNA Marker（片段大小適中）的預染(ran)/泡染(ran)對比

Figure.4 適合(he) 3% 凝膠濃度的 DNA Marker（小片(pian)段較多）的預染/泡染對比

結果分析：
從 fig.1 到 fig.4 的整體對比中可以清晰的看出，Marker 在預染膠中的條帶會發生彎曲成「W」型，且條帶大小越大，彎曲越明顯；而在泡染膠中，電泳時沒有染料的影響，條帶基本正常。

從 fig.1、fig.2 的兩種方法的對比中可以看出，在預染膠中，5kb 及以上的大分子  DNA 條帶更容易會出現變形、分不開的現象，而在泡染膠中 Marker 條帶是清晰分開的。

此外，DNA 的濃度也是需要考慮的因素，濃度越高，則結合的染料分子越多，遷移阻力也越大，同樣更容易出現條帶變形或分不開的問題。
 

總結

由于新型核酸染料會影響 DNA 分子在電泳時的遷移，特別是大分子的核酸，所以，如果在實驗中用到大分子量的 DNA Marker 或者用預染法電泳時 Marker 條帶出現彎曲、分不開的現象，建議使用泡染法進行染色。
 

此外，使用新型染料預染時一定要注意 Marker 及樣品用量。由于不同 Marker 的濃度不一樣，因此可以做幾個梯度進行加樣，選擇較合適的用量。也可以用 1X 上樣緩沖液對 Marker 進行不同倍數稀釋后使用，可以更有效地改善條帶異常的問題。不過只有使用后染法才能真正避免染料對核酸遷移的影響。

延伸問題：

Q1: 為什么同時電泳的樣品 DNA 條帶正常？

A:  因為樣品往往是單一條(tiao)帶(dai)，或條(tiao)帶(dai)數量比較(jiao)少，沒有 Marker 那么多，那么就不容易產生(sheng)條(tiao)帶(dai)間的擠(ji)壓，所(suo)以看(kan)起來是比較(jiao)正常的。但是大(da)片(pian)段或高(gao)濃(nong)度片(pian)段會(hui)結(jie)合較(jiao)多的染(ran)(ran)料，因此(ci)遷移速率依(yi)然會(hui)降低，所(suo)以也要(yao)注意樣品用(yong)量。必要(yao)時建(jian)議采用(yong)后染(ran)(ran)法進行(xing)染(ran)(ran)色。

Q2: 為什么上面的預染實驗結果沒有出現條帶劇烈變形、堆積、亮度很高的情況？

A:  因(yin)為(wei)嚴格按(an)照使用(yong)建議(yi)添加了適量的染(ran)料，使其(qi)終濃度為(wei) 1X，而(er)不(bu)是隨意添加一些使其(qi)過量，那樣非常(chang)(chang)容易加重 DNA 條(tiao)帶異常(chang)(chang)的情況。

后染法真的很麻煩嗎？

后染并不麻煩，而且配制的染色液可以多次使用，缺點是比前染法稍微耗費染料、染色時間長（20~30 min）、靈敏度略低一些。
 

但是 5kb 及以上片段較多、濃度較高的 Marker 或樣品，如果前染的結果已經如本文開頭那樣差了，那么建議還是用后染法得到一張清晰好看的電泳圖。 
 

后(hou)染法與前染法效果對(dui)比(bi)

含有 5kb 及以上的 DNA 片段建議采用后(hou)染(ran)法(fa)