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細(xi)胞凋亡-Hoechst 染色(se)試劑盒

●  產品(pin)組(zu)成：

● 產品(pin)簡介(jie)：

Hoechst 33258也(ye)稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分(fen)子式為C₂₅H₂₄N₆O·3HCl，分子量為533.88，CAS Number 23491-45-4。該(gai)染(ran)料是(shi)一種可(ke)以穿透細胞膜的(de)(de)藍色(se)熒光染(ran)料，對細胞的(de)(de)毒性較低，常用于細胞凋亡檢(jian)測(ce)，染(ran)色(se)后可(ke)用熒光顯微鏡觀察(cha)或流式細胞儀檢(jian)測(ce)。Hoechst 33258也(ye)用于(yu)普(pu)通的細(xi)胞核(he)染色、DNA染(ran)色。

Hoechst 33258的最大激發(fa)波長為346nm，最大發(fa)射波長為460nm，與(yu)雙鏈DNA結合后(hou)，最大激(ji)發波(bo)長(chang)為352nm， 最大發射波長為461nm。

Hoechst染色試劑盒(Hoechst Staining Kit)為(wei)您提供了一種經典而(er)又快(kuai)速簡便的(de)細胞凋亡檢測方法。細胞發(fa)生凋亡時，染色質會固縮(suo)。所(suo)以Hoechst 33258染(ran)色后，在熒光顯(xian)微鏡下觀(guan)察，正常細(xi)(xi)胞的(de)細(xi)(xi)胞核呈正常的(de)藍色，而凋亡細(xi)(xi)胞的(de)細(xi)(xi)胞核會呈致密濃染(ran)，或(huo)呈碎塊狀致密濃染(ran)，顏色有些發(fa)白(bai)。

按照每次使用(yong)0.5 ml染色(se)液計算，該試劑盒可以使(shi)用100次(ci)。

● 貯存：

4℃避光保存(cun)，一年有(you)效(xiao)。

● 操作步(bu)驟(zou)：

一. 鐵壁(bi)細胞(bao)：

1.1 取潔(jie)凈蓋玻片在(zai)70%乙醇中(zhong)浸泡5分鐘或更長時間，無(wu)菌(jun)超凈臺內(nei)吹干(gan)或用無(wu)菌(jun)的PBS洗滌三遍，再用細胞(bao)培養液洗滌一遍。將蓋玻片置(zhi)于六孔板內(nei)，種入細胞(bao)培養過(guo)夜，生長至50%-80%滿度。

1.2刺激細胞發生凋亡后，吸盡培養液(ye)，加入0.5 ml固(gu)定(ding)液(ye)，固(gu)定(ding)10分鐘(zhong)或更長時間(可4℃過夜)。

1.3去盡(jin)固(gu)定液(ye)，用(yong)PBS洗(xi)兩遍，每(mei)次3分鐘，吸(xi)盡(jin)液(ye)體。洗(xi)滌時宜用(yong)搖床或手動晃(huang)動。

1.4加入(ru)0.5 ml Hoechst 33258染(ran)色液，37℃避光(guang)染(ran)色10-15分鐘，手動晃動數次。

1.5去盡(jin)染色(se)液(ye)，用PBS洗兩遍，每次3分鐘(zhong)，吸盡(jin)液(ye)體。洗滌時宜(yi)用搖(yao)床或手動晃(huang)動。

1.6滴一滴抗熒光淬(cui)滅(mie)封片液(ye)于載(zai)玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液(ye)，盡量避免氣泡。

1.7 熒光顯微鏡使用紫外激發(fa)，可(ke)檢測到呈藍色的細胞核。激發(fa)波長350nm左右，發(fa)射波長460nm左右。

注(zhu)：熒光染料都(dou)存(cun)在(zai)淬滅(mie)的問題，建議染色(se)后盡(jin)快檢測。

二.懸浮(fu)細胞：

2.1 500 g（2400 rpm，下(xia)同(tong)）離心收(shou)集凋亡處理后(hou)細(xi)胞樣(yang)品于1.5 ml離心管(guan)內，加(jia)入(ru)0.5 ml固(gu)定(ding)液(ye)，緩(huan)緩(huan)懸起細(xi)胞，常(chang)溫(wen)固(gu)定(ding)10分鐘或(huo)更長時間(可4℃過夜)。

2.2離心(xin)去盡固定液，用PBS洗兩遍(bian)，每(mei)次(ci)(ci)3分鐘，洗滌期間手動晃動數(shu)次(ci)(ci)。

2.3 細胞沉淀(dian)中加(jia)入0.5 ml Hoechst 33258染色(se)液(ye)，37℃避(bi)光(guang)染色(se)10-15分鐘(zhong)，手動(dong)晃動(dong)數次。

2.4 離心收集(ji)沉淀，重懸于(yu)100 μl PBS中。

2.5 取5 μl抗(kang)熒光(guang)淬滅封片(pian)(pian)液于(yu)載(zai)玻片(pian)(pian)上(shang)，加入(ru)等體(ti)積步驟2.4染色(se)后細胞重(zhong)懸液，蓋(gai)上(shang)一潔(jie)凈的(de)蓋(gai)玻片(pian)(pian)，盡量避免(mian)氣(qi)泡。

2.6 熒光顯微(wei)鏡(jing)下紫外(wai)激發，可檢測(ce)到(dao)呈藍色的細胞核(he)。激發波(bo)長350 nm左右，發射波(bo)長460 nm左右。

注：熒光染料都(dou)存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

三 實驗示例(li)

操作流程：使用不同濃度星飽菌素（Staurosporine，STS）凋亡處理Jurkat細胞。調整細胞密度為1×10⁶/ml，每孔2 ml接種于六孔板中；加入終濃度為0，0.1，0.5，1，2，4 μM STS，37℃ 5%CO₂培養3小時；500 g 3 min收集細胞；細胞沉淀中加入1 ml固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10 min；離心后細胞沉淀重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細胞懸液滴于載玻片上，加5 μl 抗熒光淬滅劑，封片觀察。