細胞凋(diao)亡與壞死檢測試劑盒
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貨號(hao)
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名(ming)稱(cheng)
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規格(ge)
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AH1060
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細胞(bao)凋亡與壞死(si)檢測(ce)試劑盒
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100次
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● 產品(pin)組成：
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組分貨號
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名(ming)稱
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規格
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貯存
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AH1060-01
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細胞染色緩沖液
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100
ml
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4℃
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AH1060-02
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Hoechst
33342染色液
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0.5
ml
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-20℃
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AH1060-03
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PI染色(se)液
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0.5
ml
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-20℃
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說(shuo)明書
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一份(fen)
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● 產(chan)品簡(jian)介：
細(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)與(yu)壞死(si)(si)檢測試(shi)劑(ji)(ji)盒(Apoptosis and Necrosis
Assay Kit)可(ke)以(yi)快速檢測細(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)與(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)壞死(si)(si)。本(ben)試(shi)劑(ji)(ji)盒采用Hoechst 33342和碘化(hua)丙(bing)啶(ding)(ding)(Propidium Iodide，PI)雙染的方法。細(xi)(xi)胞(bao)(bao)發(fa)生(sheng)凋(diao)(diao)亡(wang)時，染色(se)(se)質會(hui)固縮。Hoechst 33342可(ke)以(yi)穿(chuan)透(tou)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜，染色(se)(se)后(hou)凋(diao)(diao)亡(wang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)熒(ying)光(guang)會(hui)比正常細(xi)(xi)胞(bao)(bao)明顯(xian)增強(qiang)(qiang)。碘化(hua)丙(bing)啶(ding)(ding)(PI)不(bu)能穿(chuan)透(tou)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜，對(dui)于(yu)具有完整細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜的正常細(xi)(xi)胞(bao)(bao)或凋(diao)(diao)亡(wang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)不(bu)能染色(se)(se)。而(er)對(dui)于(yu)壞死(si)(si)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，其細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜的完整性喪(sang)失，碘化(hua)丙(bing)啶(ding)(ding)(PI)可(ke)以(yi)染色(se)(se)壞死(si)(si)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。上述兩(liang)種染料雙染后(hou)，使用流(liu)式細(xi)(xi)胞(bao)(bao)儀或熒(ying)光(guang)顯(xian)微鏡檢測時，正常細(xi)(xi)胞(bao)(bao)為(wei)(wei)弱紅(hong)(hong)色(se)(se)熒(ying)光(guang)＋弱藍(lan)色(se)(se)熒(ying)光(guang)，凋(diao)(diao)亡(wang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)為(wei)(wei)弱紅(hong)(hong)色(se)(se)熒(ying)光(guang)＋強(qiang)(qiang)藍(lan)色(se)(se)熒(ying)光(guang)，壞死(si)(si)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)為(wei)(wei)強(qiang)(qiang)紅(hong)(hong)色(se)(se)熒(ying)光(guang)＋強(qiang)(qiang)藍(lan)色(se)(se)熒(ying)光(guang)。
按照每個樣品細胞數量100萬計算，該試劑盒可(ke)以使用100次。
● 貯存：
避光(guang)按照標簽溫(wen)度保存，一年(nian)有效。
● 操(cao)作步驟：
一. 貼壁細胞：
1.1在培養液中（細胞(bao)數量控制在106以(yi)內）均勻(yun)滴加適量的Hoechst 33342染色(se)液(ye)和PI染色(se)液(ye)，輕(qing)柔混(hun)勻(yun)。例如對于(yu)十二(er)孔(kong)板(ban)中(zhong)培(pei)養的貼壁細胞(bao)，每孔(kong)有(you)1 ml的培(pei)養液(ye)，每孔(kong)需(xu)要(yao)加入5 μl Hoechst 33342染色(se)液(ye)和5 μl PI染色(se)液(ye)。培(pei)養液(ye)中(zhong)的血清(qing)、酚紅等(deng)都不(bu)會對染色(se)產生干擾。
1.2混(hun)勻，37℃培(pei)養(yang)15分鐘，直(zhi)接在顯微鏡(jing)下觀(guan)察(cha)(cha)；如果考慮到液(ye)體對拍照的乙酰個，可(ke)以吸除含染料(liao)的培(pei)養(yang)液(ye)，用(yong)染色緩沖液(ye)洗滌2-3次即(ji)可(ke)在熒(ying)光顯微鏡(jing)下觀(guan)察(cha)(cha)。
注：為避免凋(diao)亡細胞(bao)隨培養(yang)液或染色緩(huan)沖(chong)液被吸(xi)除，在吸(xi)除液體前，對于用(yong)多(duo)孔板中培養(yang)的細胞(bao)，最(zui)好用(yong)多(duo)孔板離心(xin)機離心(xin)一下以(yi)充分沉淀那(nei)些已經漂(piao)浮起來的凋(diao)亡細胞(bao)。
二(er). 懸(xuan)浮細胞：
2.1 在懸(xuan)浮細胞培(pei)養液(ye)(ye)中(zhong)加(jia)入適量的(de)Hoechst
33342染(ran)色(se)液(ye)(ye)和(he)PI染(ran)色(se)液(ye)(ye)，輕(qing)柔(rou)混(hun)勻。例(li)如對于十二孔(kong)(kong)板中(zhong)培(pei)養的(de)懸(xuan)浮細胞，每孔(kong)(kong)有(you)1 ml的(de)培(pei)養液(ye)(ye)，每孔(kong)(kong)需要加(jia)入5 μl Hoechst 33342染(ran)色(se)液(ye)(ye)和(he)5 μl PI染(ran)色(se)液(ye)(ye)。培(pei)養液(ye)(ye)中(zhong)的(de)血清(qing)、酚紅等(deng)都不會對染(ran)色(se)產生干擾。
2.2混勻，37℃培養15分(fen)鐘(zhong)，將細(xi)胞轉移(yi)到1.5 ml離(li)心(xin)管中(zhong)，500 g 離(li)心(xin)5分(fen)鐘(zhong)收集細(xi)胞。
2.3細(xi)胞(bao)沉(chen)淀用(yong)細(xi)胞(bao)染色緩沖液(ye)(ye)洗兩(liang)遍，每次3分鐘，吸(xi)盡(jin)液(ye)(ye)體。洗滌時宜用(yong)搖床或(huo)手動晃動。
2.4細(xi)胞(bao)沉(chen)淀中加入100 μl 細(xi)胞(bao)染(ran)色緩(huan)沖液，重懸沉(chen)淀。
2.5取5 μl抗熒光(guang)淬滅封片液(ye)于(yu)載(zai)玻片上，加入(ru)等體積步驟2.4染(ran)色(se)后(hou)細胞重懸(xuan)液(ye)，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
2.6 熒光顯微鏡下(xia)觀察。
注：熒光(guang)染(ran)料都存在(zai)淬滅的問題，建(jian)議染(ran)色(se)后盡快檢測。
實驗示例：
293 細胞Hoechst/PI雙(shuang)染檢(jian)測
操作(zuo)程序：293細(xi)(xi)胞(bao)胰(yi)酶消化后調(diao)整細(xi)(xi)胞(bao)密度為1×105/ml。接種(zhong)到(dao)12孔(kong)板，1ml每孔(kong)，37度5%二氧化碳培養40小時，加入(ru)5 μl Hoechst 33342染色液和(he)5 μl 碘化丙啶染色液，37度培養15分鐘，熒光顯微鏡觀察（40×）。