AnnexinV-FITC/PI細(xi)胞凋亡檢測試(shi)劑盒
AnnexinV-FITC/PI Apoptosis Detection Kit
● 產品組成：
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貨號
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名稱
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規(gui)格
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FP2050M
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AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡(wang)檢測(ce)試劑盒
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50次
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● 產品簡介：
在(zai)正(zheng)常細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)中，磷脂(zhi)(zhi)酰絲(si)氨酸（PS）只(zhi)分布在(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)脂(zhi)(zhi)質(zhi)雙層的(de)內(nei)側，而在(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)早期，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)中的(de)磷脂(zhi)(zhi)酰絲(si)氨酸（PS）由脂(zhi)(zhi)膜(mo)內(nei)側翻(fan)向外側。Annexin V 是一(yi)種分子(zi)量為35～36kD 的(de)Ca2+依賴性(xing)磷脂(zhi)(zhi)結合蛋(dan)白，與(yu)磷脂(zhi)(zhi)酰絲(si)氨酸有高(gao)度親和(he)力，故可通(tong)過細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)外側暴露的(de)磷脂(zhi)(zhi)酰絲(si)氨酸與(yu)凋(diao)(diao)亡(wang)早期細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)結合。因(yin)此Annexin V被作(zuo)為檢(jian)測細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)早期凋(diao)(diao)亡(wang)的(de)靈敏指標之一(yi)。將(jiang)Annexin V 進行熒光(guang)(guang)素FITC 標記，以(yi)標記了的(de)Annexin V 作(zuo)為熒光(guang)(guang)探針，利用熒光(guang)(guang)顯微鏡或流式細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)儀可檢(jian)測細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)的(de)發生。碘化丙啶(ding)（Propidium Iodide, PI）是一(yi)種核酸染(ran)料，它不(bu)能透(tou)過完(wan)整的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)，但對凋(diao)(diao)亡(wang)中晚期的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)死細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，PI 能夠透(tou)過細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)而使(shi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)核染(ran)紅。因(yin)此將(jiang)Annexin V 與(yu)PI 匹(pi)配使(shi)用，就可以(yi)將(jiang)處于不(bu)同凋(diao)(diao)亡(wang)時期的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)區分開(kai)來。
以(yi)每次使用5 μl Annexin V-FITC計算，本試劑盒(he)FP2050M可(ke)以(yi)檢測50個(ge)樣品。
● 包裝組份：
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產品(pin)編號
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產品名稱(cheng)
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規格
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FP2050M-1
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Annexin V-FITC
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250 μl
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FP2050M-2
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Annexin V-FITC結(jie)合液
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30 ml
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FP2050M-3
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碘化丙啶染色(se)液(ye)
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250 μl
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● 保存條件：
4oC保存，一年有(you)效。Annexin V-FITC和碘化丙啶(ding)染色(se)液需要避(bi)光保存。
● 操(cao)作步驟：
一. 懸浮細胞操作流(liu)程：
1.1 誘導凋亡的(de)操作步驟 (以Jurkat細胞為例(li))：
1.1.1 制(zhi)備(bei)1×106個(ge)/ml 的Jurkat細胞懸液。
1.1.2 加入(ru)終(zhong)濃(nong)度為1 μM 的凋亡誘導劑 (STS，Staurosuporine，星孢菌(jun)素)。
1.1.3 在37℃培養箱培養3 h。
注：1 μM Staurosuporine用于(yu)誘導Jurkat cell凋亡。最佳誘導條件請根據實驗的細胞類型與誘導劑調整。
1.2 Annexin V染色操作步驟：
1.2.1 將細(xi)胞(bao)懸液轉移到離心(xin)管中，500 g（2500 rpm）離心(xin)3 min，去(qu)除上清(qing)液。
1.2.3沉淀中加入PBS，500 g（2500 rpm）離(li)心(xin) 3 min，去除(chu)上清液。重復漂洗一次。
1.2.4加入Annexin V-FITC結合液，制成終(zhong)濃度為1×106 個/ml的細胞懸(xuan)液。
注：加入結合液的體積根(gen)據實驗目的自行調整，一般推薦(jian)不少于500 μl。
1.2.5 取100 μl步驟1.2.4中制(zhi)備的細胞(bao)懸(xuan)液，加(jia)入到(dao)一個(ge)新的離心管(guan)中。
1.2.6 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙(bing)啶染色液。
1.2.7 常溫下(xia)避光放置15 min，即為待(dai)檢液。
1.3 結果檢測：
1.3.1 流式細胞儀(yi)檢測：
步驟1.2.7中的(de)(de)待檢(jian)液(ye)中加(jia)入(ru)400 μl Annexin
V-FITC結合液(ye)。激發波長Ex = 488 nm；發射波長Em = 530 nm。Annexin V-FITC的(de)(de)綠色熒光(guang)通(tong)(tong)(tong)過FITC通(tong)(tong)(tong)道(dao) (FL1) 檢(jian)測；PI的(de)(de)紅色熒光(guang)通(tong)(tong)(tong)過PI 通(tong)(tong)(tong)道(dao) (FL2或(huo)FL3) 檢(jian)測。注(zhu)：熒光(guang)染料(liao)都存在淬滅(mie)的(de)(de)問(wen)題，建(jian)議1小時內完成檢(jian)測。
1.3.2 熒(ying)光顯微鏡檢測：
取步驟1.2.7的待檢液5 μl滴于載玻(bo)片上，加5μl 抗熒光淬滅封片液，封片觀察。
注：熒光染(ran)料都存在淬(cui)滅的問題，建議(yi)染(ran)色(se)后(hou)盡(jin)快檢測(ce)。
二. 懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)操作流程：
2.1 誘導凋亡(wang)的操作步(bu)驟 (以Caco-2細胞(bao)為例)：
2.1.1 制(zhi)備1×106個/ml 的Caco-2細胞懸液，將細胞懸液接種到(dao)培(pei)養皿或者培(pei)養板中。
2.1.2 在(zai)37℃ 5% CO2培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)預(yu)培(pei)養(yang)。
2.1.3加入終濃度為25 μM的(de)凋亡誘導劑 (Cisplatin，順鉑)。
2.1.4 在37℃5% CO2培(pei)養箱(xiang)中培(pei)養4 days。
2.2 Annexin V染(ran)色操作步驟：
2.2.1吸出(chu)細(xi)胞(bao)培(pei)養液至離心管中待用，細(xi)胞(bao)用PBS洗滌，加(jia)入適量不(bu)含EDTA的胰酶(mei)細(xi)胞(bao)消(xiao)化(hua)液消(xiao)化(hua)細(xi)胞(bao)。
2.2.2 常溫(wen)孵育至輕輕吹(chui)打可以使貼壁細胞吹(chui)打下來(lai)時(shi)，吸除胰酶細胞消化(hua)液。需避免胰酶的過(guo)度消化(hua)。
2.2.3加入步(bu)驟2.2.1中(zhong)收集的細胞(bao)培養液，稍混勻(yun)，轉移到離心(xin)(xin)管內，2000 rpm
5 min，小心(xin)(xin)吸除上清。
注意：加(jia)入的(de)細胞(bao)培養液一方面(mian)可(ke)以收集(ji)已經懸浮的(de)發生凋亡(wang)或壞死(si)的(de)細胞(bao)，另一方面(mian)細胞(bao)培養液中的(de)血清可(ke)以有效(xiao)抑制(zhi)或中和殘留(liu)的(de)胰酶(mei)；殘留(liu)的(de)胰酶(mei)會消化并降解后(hou)續加(jia)入的(de)Annexin V-FITC導致(zhi)染色失敗。
2.2.4 細胞(bao)沉淀(dian)中(zhong)加入(ru)預冷(leng)PBS輕輕重懸(xuan)細胞(bao)，2000 rpm 5
min，小心吸除上(shang)清；重復(fu)洗滌一次。
2.2.5細胞沉淀中(zhong)加入適量(liang)Annexin V-FITC結合液，制成終濃度為1×106 個/ml的(de)細胞懸液。
注：加入結合液的(de)體積根據實驗目的(de)自行調整，一般推薦不少(shao)于500 μl。
2.2.6 取100 μl步驟2.2.5中制備的(de)細胞懸液，加入到一個(ge)新的(de)離心管(guan)中。
2.2.7 向細胞懸(xuan)液(ye)(ye)中加(jia)入(ru)(ru)5 μl Annexin V-FITC，再加(jia)入(ru)(ru)5 μl 碘(dian)化丙(bing)啶染色液(ye)(ye)。
2.2.8 常(chang)溫下避光放(fang)置15 min，即為待(dai)檢液。
2.3 結果(guo)檢測：
2.3.1 流式細(xi)胞儀檢測：
步驟2.2.8中(zhong)的(de)(de)待(dai)檢(jian)液中(zhong)加入(ru)400 μl Annexin
V-FITC結合液。激發波長Ex = 488 nm；發射波長Em = 530 nm。Annexin V-FITC的(de)(de)綠色(se)熒光通(tong)(tong)過FITC通(tong)(tong)道 (FL1) 檢(jian)測(ce)；PI的(de)(de)紅(hong)色(se)熒光通(tong)(tong)過PI 通(tong)(tong)道 (FL2或FL3) 檢(jian)測(ce)。注：熒光染料(liao)都存在淬(cui)滅的(de)(de)問題，建議1小時(shi)內完(wan)成檢(jian)測(ce)。
2.3.2 熒光顯微鏡檢測：
取(qu)步驟2.2.8的待檢液(ye)5 μl滴于載玻片上，加5μl 抗熒光淬滅封片液(ye)，封片觀察。
檢測程序：
Jurkat細胞調整到1×106/ml，6孔板接種(zhong)2 ml；凋亡處理加10 μl 0.2 M STS（星型飽菌素），終(zhong)濃度(du)為1 μM；37度(du) 5%二氧化碳培養3小時(shi)；2 ml收(shou)集(ji)，PBS漂洗2次(ci)，重(zhong)懸于300 μl 結合液(ye)中；調(diao)整細(xi)胞(bao)密度(du)為1×106/ml制成細(xi)胞(bao)懸液(ye)。取100 μl細(xi)胞(bao)懸液(ye)加5 μl Annexin V-FITC，5 μl 碘化丙啶染色液(ye)，RT 避(bi)光靜置15min，取5 μl加5 μl封片液(ye)，封片觀察。FITC（+）PI（+）為凋亡晚期(qi)細(xi)胞(bao)（40×）。
● 注意(yi)事項：
1. 本(ben)試劑盒適(shi)用于檢(jian)測活細胞，流式細胞儀檢(jian)測時，細胞數量(liang)不應低于1×106，不(bu)推薦用于檢測組織樣本(ben)。
2. 推薦使用懸浮(fu)培養細(xi)胞。如果是貼壁細(xi)胞，需(xu)用不含 EDTA
的胰(yi)酶消(xiao)化(hua)，如消(xiao)化(hua)不當，可能引起(qi)假陽性(xing)，而用細(xi)胞刮子會造成細(xi)胞粘(zhan)連成團，而影響檢測。
3. 細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。
4. 消化貼壁(bi)細胞殘留(liu)的胰酶(mei)會消化并降解Annexin
V-FITC，最(zui)終導致(zhi)染色失敗。
5 .因檢(jian)測(ce)細胞的(de)類(lei)(lei)型、凋(diao)亡誘導(dao)劑(ji)種類(lei)(lei)、使(shi)用(yong)的(de)檢(jian)測(ce)儀(yi)器不同，因而流(liu)式檢(jian)測(ce)的(de)熒(ying)光補償也不同，因此建議(yi)每次(ci)檢(jian)測(ce)均需(xu)使(shi)用(yong)未(wei)經凋(diao)亡誘導(dao)處(chu)理的(de)細胞作為對照(zhao)，進行熒(ying)光補償的(de)調(diao)節。