IPTG即用型溶液
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產品編號
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產品名稱
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包裝
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貯存
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IP0560
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IPTG 50mg/ml
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5ml
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-20℃
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說明書
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一份
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● 產品簡介：
藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞閱讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的(de)(de)氨基端片(pian)段，使(shi)得帶有重(zhong)組(zu)質(zhi)粒(li)的(de)(de)細(xi)菌(jun)形(xing)(xing)成(cheng)白(bai)色菌(jun)落(luo)。這種重(zhong)組(zu)子的(de)(de)篩選，又稱為(wei)藍(lan)白(bai)斑篩選。如用藍(lan)白(bai)斑篩選則經連接(jie)產(chan)物轉化(hua)的(de)(de)鈣化(hua)菌(jun)平板(ban)37℃倒(dao)置(zhi)培養12-16hr后，含有插入片(pian)段重(zhong)組(zu)質(zhi)粒(li)的(de)(de)細(xi)菌(jun)形(xing)(xing)成(cheng)白(bai)色菌(jun)落(luo)，而(er)沒有插入片(pian)段的(de)(de)質(zhi)粒(li)細(xi)菌(jun)形(xing)(xing)成(cheng)藍(lan)色菌(jun)落(luo)。
該溶液為50mg/ml
（0.2
M）IPTG
的(de)(de)水溶液，已經過濾(lv)除(chu)菌，可以(yi)直接使(shi)用。除(chu)用于細菌的(de)(de)藍白(bai)篩選外，該溶液也可用于誘導蛋白(bai)的(de)(de)表達等實驗。
● 藍白篩選實驗程序：
1
轉(zhuan)化平(ping)板的制備(bei)：
向鋪好的(de)含有相應抗生(sheng)素的(de)固體瓊脂平板表(biao)面加入16
μl的(de)IPTG(50
mg/ml)、40
μl的(de)X-gal(20
mg/ml)，使用無菌的(de)彎頭玻(bo)璃棒將其均(jun)勻的(de)涂開(kai)，盡(jin)量(liang)使溶(rong)解X-gal的(de)二甲基甲酰胺(an)揮發干凈。
2
轉化
i. 取部(bu)分連接(jie)產(chan)(chan)(chan)物加(jia)到50-100
μl感受態(tai)細胞(bao)中（感受態(tai)細胞(bao)應剛(gang)(gang)從-70℃冰(bing)箱取出放于冰(bing)浴上，待剛(gang)(gang)剛(gang)(gang)解凍時加(jia)入(ru)連接(jie)產(chan)(chan)(chan)物，連接(jie)產(chan)(chan)(chan)物的加(jia)入(ru)量(liang)不超過感受態(tai)細胞(bao)體積的十分之一），輕(qing)彈(dan)混勻，冰(bing)浴30分鐘(zhong)。
ii. 將離(li)心(xin)管(guan)置(zhi)于精(jing)確42℃水(shui)浴90秒，取出(chu)管(guan)后立即(ji)置(zhi)于冰浴中放置(zhi)2-3分鐘，其(qi)間(jian)不要搖動離(li)心(xin)管(guan)。
iii. 向離心管中加入250-500
μl37℃預熱的(de)SOC或LB(不(bu)含抗(kang)(kang)生(sheng)素)培養(yang)基，150rpm，37℃振蕩培養(yang)45分鐘。此步目的(de)是使(shi)質粒上(shang)相(xiang)關的(de)抗(kang)(kang)性(xing)標記基因(yin)表達，使(shi)菌體復蘇(su)。
iv. 將離心管中的(de)菌液混勻，吸取100
μl加到含相(xiang)應(ying)抗生素(su)的(de)SOB或LB固體瓊脂(zhi)培養基(ji)上，用無菌的(de)彎頭(tou)玻棒(bang)輕輕的(de)將細胞均勻涂開。待(dai)平板(ban)表(biao)面干燥后，倒(dao)置平板(ban)，37℃培養12-16小時。
3
檢測
將得到的白(bai)色菌(jun)落接種1-5 ml LB培(pei)(pei)養基，37℃搖床振蕩培(pei)(pei)養過夜，保存菌(jun)種后提(ti)取質粒，應(ying)用(yong)PCR或酶切(qie)方法(fa)鑒(jian)定插入片段(duan)是否(fou)正確。
X-gal/IPTG發表文章列表：
1. [2022
IF=2.7] Functional verification of the JmLFY gene associated with the
flowering of Juglans mandshurica Maxim..
Author: Jiayou Cai, Ruoxue Jia, Ying Jiang, Jingqi Fu, Tianyi Dong,
Jifeng Deng, Lijie Zhang.
Journal: Peer J Published
March 7, 2023
Institution: Shenyang Agricultural University
Paper
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