植物過(guò)氧化物酶POD活性測(cè)定試劑盒（分光法）
Plant Peroxidase Activity Assay Kit（Spectrophotometer Method） Ver.751165-1.0
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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PD1050F
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植物過(guò)氧化物酶POD活性測(cè)定試劑盒（分光法）
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100次
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● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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PD1050F-01
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提取緩沖液
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110 ml
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4℃
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PD1050F-02
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試劑1-顯色劑
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25 ml
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4℃，避光
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PD1050F-03
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試劑2-分析緩沖液
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75 ml
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4℃
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PD1050F-04
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試劑3-酶底物
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6 ml
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4℃，避光
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）是一種活性較高、廣泛存在于植物組織器官中的氧化還原酶，以鐵卟啉為輔基，能催化過(guò)氧化氫（H2O2）直接氧化酚類或胺類化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，有效防止過(guò)氧化氫在體內(nèi)的積累，從而對(duì)植物體起到保護(hù)作用；同時(shí)，過(guò)氧化物酶能使植物組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素,是細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶。所以，POD與植物體內(nèi)物質(zhì)代謝及抗逆性都有著密切關(guān)系。
測(cè)定原理：用愈創(chuàng)木酚（即鄰甲氧基酚，Guaiacol）為過(guò)氧化物酶的底物，在過(guò)氧化物酶催化下，過(guò)氧化氫可將愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，該物質(zhì)在470 nm處有最大吸收，故可通過(guò)測(cè)470 nm下吸光值變化測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。
該試劑盒使用分光光度計(jì)，用1 ml比色皿測(cè)定植物樣品中的POD活性，以每次提取使用1 ml提取液，1 ml反應(yīng)體系計(jì)算，該產(chǎn)品可以大約使用100次。
本試劑盒適用于檢測(cè)植物組織中的過(guò)氧化物酶(POD)活力，不推薦用于動(dòng)物組織、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌以及血清樣品中POD的檢測(cè)。
● 貯存、運(yùn)輸及效期：
4℃貯存；常溫運(yùn)輸；有效期6個(gè)月。
● 自備材料：
植物材料；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；剪刀；研缽；分光光度計(jì)（最佳檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm）；1 ml玻璃或石英比色皿（光徑1 cm）；低溫臺(tái)式離心機(jī)；可調(diào)式移液器；蒸餾水等。
● 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，設(shè)定波長(zhǎng)到470 nm。
2. 測(cè)定前提前30 min取出試劑1、 試劑2和試劑3，平衡至常溫（25℃）。
3. 提前打開制冰機(jī)。
● 操作步驟：
建議正式實(shí)驗(yàn)前，選取2個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試劑浪費(fèi)。
一. 樣本POD提?。?/b>
1.1 取新鮮植物組織，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（ml）為~1：10的比例用研缽進(jìn)行冰浴研磨，制備成~10%植物勻漿液，如0.1 g 植物葉片，加入1 ml提取液，用研缽進(jìn)行冰浴研磨。
注：如果提高研磨效率，可加入適量石英砂（試劑盒不提供，自備）輔助研磨；對(duì)于多糖多酚含量高的植物，可以在提取液中加入1% PVP（試劑盒不提供，自備），能有效去除多糖多酚對(duì)活性測(cè)定的干擾。
1.2 12000 rpm，4℃離心10 min，取上清，即為含有POD的樣本，置冰上測(cè)定。
注：提取的樣本如需貯存，建議按需分裝后-80℃貯存，兩周內(nèi)使用，盡量避免反復(fù)凍融。
二. 樣本測(cè)定：
2.1 在1.5 ml離心管中依次加入：
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加入順序
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試劑名稱
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反應(yīng)體系
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對(duì)照體系
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1.5 ml離心管中加入體積（μl）
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反應(yīng)總體積1000 μl
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1
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樣本
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50
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-
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2
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試劑1-顯色劑
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200
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200
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3
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試劑2-分析緩沖液
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700
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750
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4
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試劑3-酶底物
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50
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50
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離心管中混勻后，用對(duì)照體系將儀器調(diào)零；隨后立即將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到1
ml比色皿中，在 470
nm處讀取吸光值 A1以及反應(yīng)時(shí)間后的吸光值A2，△A=A2-A1，可以間隔1
min讀數(shù)，讀取5 min內(nèi)的數(shù)值。
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2.2 由于植物樣本繁多，不同物種的POD活性差異很大，有的物種活性很高（反應(yīng)啟動(dòng)后混合液顏色很快由橘黃色變?yōu)榧t褐色）；有的物種活性很低（反應(yīng)啟動(dòng)后 5 分鐘內(nèi)混合液不變色），吸光值只有小數(shù)點(diǎn)后三位的變化。強(qiáng)烈建議先取 2-3 個(gè)樣本做個(gè)預(yù)測(cè)定，如果反應(yīng)啟動(dòng)后混合液顏色很快由橘黃色變成紅褐色，A1值大于1 或ΔA大于1，說(shuō)明酶活性過(guò)高，可降低樣本量 V1（如減至 20 μl， 則試劑2相應(yīng)增加20
μl），改變后的 V1 需代入公式重新計(jì)算，也可將樣本的提取上清液用提取液稀釋 5-10倍后重新檢測(cè)，計(jì)算公式中要乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)（D）。如果
A1 值很小（＜0.05），且△A 很?。ǎ?.005），且反應(yīng)啟動(dòng)后一段時(shí)間沒(méi)有顯色（一般5 min內(nèi)），說(shuō)明酶活性很低，可增加樣本量 V1（如增至 100 μl，則試劑2相應(yīng)減少100 μl），或可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如延長(zhǎng)到 5 min 后讀取 A2），改變后的 V1 和 T 需代入公式重新計(jì)算。
2.3 若吸光值的上升趨勢(shì)不穩(wěn)定，可全部加完所有試劑后讀取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光值，根據(jù)時(shí)間對(duì)
吸光值的線性回歸曲線，選取一段線性增長(zhǎng)范圍讀取△A值（參見實(shí)驗(yàn)示例）。
2.4 若檢測(cè)體系不變，可按照樣本檢測(cè)數(shù)量，預(yù)先把試劑1，試劑2和試劑3按照 200:700:50 比例配成所需體積的混合液，在加樣表中直接加一槍 950 μl 混合液即可。
三. 活性計(jì)算：
3.1 按樣本鮮重（FW）計(jì)算：
酶活定義：每克植物組織鮮重（FW）每分鐘在1000 μl反應(yīng)體系中使470 nm 處吸光值增加1為一個(gè)酶活力單位U。
計(jì)算公式：POD（U/g FW）＝ΔA÷(FW×V1÷V)÷T×D
3.2 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
注：此方法需要測(cè)定提取液的蛋白濃度，推薦使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào):RTP7102）。
酶活定義：每毫克蛋白（mg prot）每分鐘在1000 μl反應(yīng)體系中使 470 nm 處吸光值增加0.001為一個(gè)酶活力單位 U。
計(jì)算公式：POD（U/mg prot） ＝ΔA÷(V1×Cpr)÷T÷0.001×D
注解：
V：步驟1.1中加入提取液體積（μl）
V1：步驟2.1中加入樣本的體積（μl）
T：步驟2.1讀取兩次A470的間隔反應(yīng)時(shí)間（min）
FW：步驟1.1中樣本鮮重質(zhì)量（g）
Cpr：步驟3.2中，樣本蛋白濃度（mg/ml）
D：步驟2.2中，如果酶活性過(guò)高，需要稀釋的倍數(shù)，未稀釋即為1
四. 實(shí)驗(yàn)示例：
4.1 綠蘿POD活性測(cè)定-按樣本鮮重（FW）計(jì)算：
取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，按照測(cè)定步驟操作，使用1 ml石英比色皿（光徑1 cm），設(shè)定分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm，間隔1 min記錄數(shù)據(jù)，采集5次；時(shí)間對(duì)吸光值做線性回歸曲線，3-4 min線性較好，1 min內(nèi)△A=0.426-0. 3=0.126。
計(jì)算POD（U/g FW）=0.126÷（0.5×50÷5000）÷1×1= 25.2 U/g FW
4.2 綠蘿POD活性測(cè)定-按蛋白濃度計(jì)算：
取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上；BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：RTP7102）測(cè)定蛋白濃度為2 mg/ml；按照測(cè)定步驟操作，使用1 ml石英比色皿（光徑1 cm），設(shè)定分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm，間隔1 min記錄數(shù)據(jù)，采集5次；時(shí)間對(duì)吸光值做線性回歸曲線，0-1 min線性較好，1 min內(nèi)△A=0.189-0. 055=0.126。酶活定義：每毫克蛋白（mg prot）每分鐘在1000 μl反應(yīng)體系中使 470 nm 處吸光值增加0.001為一個(gè)酶活力單位 U。
計(jì)算公式：POD（U/mg prot）＝ΔA÷(V1×Cpr)÷T÷0.001×D
計(jì)算POD（U/mg prot）=0.126÷（50×2）÷1÷0.001×1= 1.34 U/mg prot
