RIPA裂解液(強，不含抑制劑，不含螯合劑)
● 產品包裝：
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產品編號
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產(chan)品名稱
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包裝
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說(shuo)明(ming)書
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RL0120F
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RIPA裂(lie)解液(ye)(強，不含抑制劑，不含螯合劑)
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100 ml
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1份
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● 產品簡介：
RIPA裂解液(RIPA Lysis
Buffer)是一種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂(lie)解液(ye)的配方有很多種，根(gen)據其裂(lie)解液(ye)的強度(du)大致可以(yi)分(fen)為強、中(zhong)、弱(ruo)三(san)類。該RIPA裂(lie)解液(ye)(強)的主要成(cheng)分(fen)為50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% Triton
X-100，1%
sodium deoxycholate，0.1% SDS，不(bu)含(han)蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑，不(bu)含(han)磷酸酶抑(yi)制(zhi)劑，不(bu)含(han)螯合劑如EDTA或EGTA，可適用(yong)(yong)于明膠酶譜實(shi)(shi)驗的蛋(dan)白(bai)提(ti)取。使(shi)用(yong)(yong)前根(gen)據實(shi)(shi)驗需要添加蛋(dan)白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑或磷酸酶抑(yi)制(zhi)劑以(yi)及EDTA或EGTA。
用該RIPA裂解(jie)液裂解(jie)得到的(de)蛋白樣(yang)品，可以用BCA蛋白濃度(du)測(ce)定(ding)試劑盒(he)測(ce)定(ding)蛋白濃度(du)。由(you)于含有(you)較高濃度(du)的(de)去(qu)垢劑，不能用Bradford法(fa)測(ce)定(ding)蛋白濃度(du)。
● 保存、效期及運輸：
-20℃保(bao)存，有效(xiao)期一年，濕(shi)冰(bing)運(yun)輸。
● 注意事項：
1.為取得最佳的(de)(de)使用效果，盡量避免(mian)過多(duo)的(de)(de)反復凍(dong)融。可(ke)以適當分(fen)裝后使用。需(xu)(xu)自(zi)備PMSF。裂解(jie)樣品的(de)(de)所(suo)有步驟都需(xu)(xu)在冰上或(huo)4℃進行。
2. RIPA裂(lie)解液的裂(lie)解產物(wu)(wu)中經常(chang)(chang)會(hui)出現一小團透明膠(jiao)狀物(wu)(wu)，屬常(chang)(chang)見現象(xiang)。該透明膠(jiao)狀物(wu)(wu)為含有(you)基因(yin)(yin)組(zu)DNA等的復(fu)合物(wu)(wu)。在不檢測與基因(yin)(yin)組(zu)DNA結(jie)合特(te)別緊密的蛋(dan)白(bai)的情況下，可(ke)(ke)以直接(jie)離心(xin)取上清用于后續實驗(yan)；如(ru)果需要(yao)檢測和(he)基因(yin)(yin)組(zu)結(jie)合特(te)別緊密的蛋(dan)白(bai)，則(ze)可(ke)(ke)以通(tong)過超聲(sheng)處理(li)打(da)(da)碎(sui)打(da)(da)散該透明膠(jiao)狀物(wu)(wu)，隨后離心(xin)取上清用于后續實驗(yan)。如(ru)果檢測一些常(chang)(chang)見的轉(zhuan)錄因(yin)(yin)子，例(li)如(ru)NF-kappaB、p53等時，通(tong)常(chang)(chang)不必進行超聲(sheng)處理(li)，就可(ke)(ke)以檢測到這(zhe)些轉(zhuan)錄因(yin)(yin)子。
● 使用說明：
1. 準備RIPA裂解液：
融解(jie)RIPA裂(lie)解(jie)液，混勻；取適當量的(de)(de)裂(lie)解(jie)液，在使(shi)用前數分鐘內加(jia)入1/100體積的(de)(de)100 mM PMSF，使(shi)PMSF的(de)(de)最終濃度為1 mM。
注：進行明膠酶譜實驗提取蛋白樣品時，不要添加EDTA或EGTA，以免螯合掉MMP活性需要的二價陽離子；蛋白酶抑制劑也要選擇性添加，不要添加金屬蛋白酶抑制劑，可以添加PMSF（絲氨酸蛋白酶抑制劑）。
2. 細胞蛋白提取：
2.1 貼壁細胞：去除培養液，加入適量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動貼壁細胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打數下，使裂解液和細胞充分(fen)(fen)接觸，冰(bing)上(shang)裂(lie)解(jie)細胞5分(fen)(fen)鐘(zhong)，用(yong)細胞刮刀(dao)刮下細胞收集于1.5 ml離心管中，冰(bing)上(shang)繼續裂(lie)解(jie)15分(fen)(fen)鐘(zhong)，間歇混勻。
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培養板規格/培養皿(min)表面積
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細胞量
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RIPA推薦使用量
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100 mm培養(yang)皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培(pei)養皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養(yang)皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔板
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔板(ban)
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5×105
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100-150 μl
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96孔板
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細胞：450 g
4℃ 離心5 min收集細(xi)胞；用適量1×PBS重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細(xi)胞；重(zhong)復漂洗細(xi)胞一次；按照細(xi)胞沉淀體積（PCV）20 μl加(jia)入200 μl RIPA的比例加(jia)入RIPA，混勻細(xi)胞沉淀，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細胞，其細胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
2.3 裂解細胞：
裂解混合物(wu)超(chao)(chao)聲波處理（超(chao)(chao)聲條(tiao)件(jian)根據儀器(qi)調整，建議(yi)條(tiao)件(jian)為）；如沒有超(chao)(chao)聲破碎儀，可以(yi)(yi)使用(yong)注射器(qi)用(yong)27G針頭處理裂解物(wu)10-15次，以(yi)(yi)徹底裂解細胞(bao)。冰浴(yu)處理15分鐘。
注：裂解(jie)(jie)中細胞會(hui)釋(shi)放出變性的核酸，呈團狀粘稠透明(ming)樣，如不進行超聲或針頭裂解(jie)(jie)處理，會(hui)導致裂解(jie)(jie)物非(fei)常粘稠，大(da)大(da)降低蛋(dan)白提取的得率和純度(du)。
2.4 離心收集上清：
充分裂解后，4℃ 16000
g離(li)心10分鐘(zhong)，取(qu)上清，即可進行后續(xu)的PAGE、Western和免疫沉淀等操(cao)作。
3. 組織樣品蛋白提取：
3.1 手(shou)術切除(chu)的組織塊(kuai)迅(xun)速置于預冷(leng)的生(sheng)理鹽水中，漂洗數次(ci)，洗凈組織血跡，用(yong)濾紙吸
干組織(zhi)表(biao)面液體，將組織(zhi)切成細小的碎片(pian)。
3.2 按照每20 mg組織加(jia)入(ru)200 μl裂(lie)解(jie)液的(de)(de)比例(li)加(jia)入(ru)裂(lie)解(jie)液。(如(ru)果裂(lie)解(jie)不充分可(ke)以適(shi)當添加(jia)更多(duo)的(de)(de)裂(lie)解(jie)液，如(ru)果需(xu)要高濃度的(de)(de)蛋白樣品(pin)，可(ke)以適(shi)當減少(shao)裂(lie)解(jie)液的(de)(de)用量。)
3.3 用玻璃勻(yun)漿器冰(bing)浴(yu)勻(yun)漿5-10次(ci)，收集勻(yun)漿后的裂(lie)(lie)解混(hun)合物(wu)，超聲波處(chu)理(li)（超聲條件(jian)(jian)根據(ju)儀器調整，建議條件(jian)(jian)為）；如沒有超聲破碎儀，可以(yi)使用注射器用27G針頭處(chu)理(li)裂(lie)(lie)解物(wu)10-15次(ci)，以(yi)徹底裂(lie)(lie)解細胞。裂(lie)(lie)解物(wu)冰(bing)浴(yu)處(chu)理(li)15分(fen)鐘。
注：裂(lie)(lie)解中細胞會(hui)釋放出(chu)變性(xing)的(de)核酸(suan)，呈團狀粘稠透明樣(yang)，如(ru)不進行超聲或針頭裂(lie)(lie)解處理，會(hui)導(dao)致裂(lie)(lie)解物非(fei)常粘稠，大大降低(di)蛋白提取的(de)得率和純度。
3.4 充分裂解后，4℃ 16000
g離心10分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western和免疫沉淀(dian)等操作。