非變性裂解液（細胞樣品）
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貨(huo)號
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產品(pin)名稱
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規格
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RL1080
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非(fei)變性裂解(jie)液（細胞樣品）
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100 ml
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● 產品簡介：
非變性裂解液（細胞樣品）（Native Lysis Buffer for
Cells）是一種用于活性提取哺乳動物細胞的胞漿蛋白、胞核蛋白的提取試劑。本產品與Thermo的M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent（Thermo貨號：78501，78503，78505）以及Sigma的CelLytic M mammalian cell
lysis/extraction reagent（Sigma貨號：C2978）為同類產品，可以考慮平替。
本產品含有一種比較溫和的非變性去垢劑，緩沖系統pH7.6，能夠確保蛋白高效抽提的同時還可以保留蛋白樣品中蛋白或酶的活性，便于進行后續的蛋白活性分析檢測。
對于使用本產品提取的蛋白溶液，如果希望去除其中的去垢劑，可以通過離心式去垢劑去除柱（貨號：DD0550）快速去除。
本產品提取的蛋白樣品，能較好地保持其原有的空間結構和生物學活性，可用于蛋白的非變性電泳和多種生物化學和細胞生物學用途。例如，Tris-甘氨酸非變性電泳（貨號：RTD6135，RTD6130）、Blue Native電泳（貨號：RTD6139，RTD6140）、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)，ELISA等常規生化分析，luciferase、β-gal、alkaline
phosphatase、chloramphenicol
acetyltransferase (CAT)等報告基因(Report
gene)酶活性檢測，PKA、PKC和酪氨酸激酶等蛋白激酶活力的檢測，以及帶有HA、Flag、Myc、V5、His和GST等標簽蛋白的分離純化等方面的用途。
使(shi)用本產品獲得的蛋白樣品可(ke)用BCA 蛋白濃(nong)度(du)測(ce)(ce)定(ding)(ding)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(貨(huo)(huo)號：RTP7102)或Bradford蛋白濃(nong)度(du)測(ce)(ce)定(ding)(ding)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)（去(qu)垢劑(ji)兼容型）（貨(huo)(huo)號：RTP7104）進行定(ding)(ding)量分(fen)析。由于(yu)含有較高濃(nong)度(du)去(qu)垢劑(ji)，不建(jian)議使(shi)用Bradford蛋白濃(nong)度(du)測(ce)(ce)定(ding)(ding)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)（貨(huo)(huo)號：RTP7101）測(ce)(ce)定(ding)(ding)蛋白含量。
本產品裂解液比較溫和，對于膜蛋白提取效果不好，不建議用于膜蛋白提取；由于(yu)組織的特殊性，本產品不(bu)建(jian)議用于(yu)組織蛋(dan)白的非變性提取。
按照每次裂解5×106細胞，每次使用0.5 ml裂解液，該產(chan)品(pin)可以提取200個樣品(pin)。
● 產品特點：
1. 高效(xiao)：提取效(xiao)率比(bi)凍(dong)融、超(chao)聲等(deng)方法效(xiao)率高。
2. 非變性：最大限度保(bao)持蛋白活性，不會干擾下(xia)游應用。
3. 方便：貼壁細胞(bao)可以直(zhi)接(jie)在器皿上裂(lie)解，不用刮下細胞(bao)。
4. 快速：可在(zai)常溫下快速裂解細胞。
● 保存、運輸及效期：
4度保(bao)存，常溫運(yun)輸，有效期兩年。
● 用前必讀：
1. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行。
2. 需自備(bei)蛋白酶抑制劑(ji)或(huo)者(zhe)購買蛋白酶抑制劑(ji)Cocktail (不含EDTA，片劑(ji)，通用型)（貨號：PC2930）和/或(huo)磷酸酶抑制劑(ji)。
● 使用說明：
1. 準備即用型裂解緩沖液：
向預(yu)冷的裂解緩(huan)沖液中(zhong)加(jia)(jia)入蛋白(bai)酶抑(yi)制劑（自(zi)備，貨號：PC2930）；如果進(jin)行磷(lin)酸化研究，還需要加(jia)(jia)入磷(lin)酸酶抑(yi)制劑（自(zi)備），混勻，冰上預(yu)冷待(dai)用。
2. 貼壁細胞總蛋白提取：
2.1 去除培養液(ye)(ye)，加入(ru)適(shi)量1×PBS，輕(qing)柔(rou)漂洗一遍(bian)，不要擾(rao)動貼壁(bi)細胞。按照下表直接在(zai)培養器(qi)皿中加入(ru)裂(lie)(lie)解(jie)(jie)液(ye)(ye)，移(yi)液(ye)(ye)器(qi)吹打數下，使裂(lie)(lie)解(jie)(jie)液(ye)(ye)和(he)細胞充分(fen)接觸，冰上裂(lie)(lie)解(jie)(jie)細胞5分(fen)鐘，間(jian)歇混勻(yun)。
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培養板規(gui)格/培養皿(min)表面(mian)積
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細胞量
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裂解液推薦(jian)使用量
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100 mm培(pei)養皿*
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~1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養皿
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~5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培(pei)養皿
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~2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔板
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~2.5×106
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200-400 μl
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24孔板
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~5×105
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100-150 μl
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96孔板
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~1×105
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50-100 μl
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注：100 mm培養皿收集的細胞量~1.5×107（50 mg），可(ke)以提取~3 mg總蛋(dan)白。
2.2 細胞(bao)收集于1.5 ml離(li)心管(guan)中，冰(bing)上繼續裂解15分鐘，間歇混(hun)勻。
2.3 4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清。
3. 懸浮細胞總蛋白提取：
3.1 450 g 4℃ 離心5 min收集細(xi)(xi)胞(bao)；用適量1×PBS重懸細(xi)(xi)胞(bao)，450 g 4℃ 離心5 min收集細(xi)(xi)胞(bao)；重復漂(piao)洗細(xi)(xi)胞(bao)一次；
3.2 按照(zhao)細胞(bao)沉淀(dian)體積（PCM）20 μl（~20 mg）加入(ru)200 μl 裂解(jie)緩沖液的比例加入(ru)裂解(jie)液，混(hun)勻細胞(bao)沉淀(dian)，冰浴處理15分(fen)鐘(zhong)，間歇(xie)混(hun)勻。
注：2×106 Jurkat細胞，其細胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl（~20 mg），可以提取~1.5 mg總蛋白。
3.3 4℃ 16000 g離心(xin)10分(fen)鐘，取上(shang)清。
4. 可選步驟：蛋白樣品去除去垢劑：
如果(guo)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)中遇(yu)到以(yi)下情(qing)況，建(jian)議進行步驟4。非變性(xing)電泳(yong)，發(fa)現樣(yang)品中的去垢劑(ji)導致泳(yong)道拖(tuo)尾；樣(yang)品中的去垢劑(ji)影響(xiang)后續實(shi)(shi)驗(yan)(yan)，如ELISA或酶活性(xing)測定；樣(yang)品中的去垢劑(ji)對質譜實(shi)(shi)驗(yan)(yan)有影響(xiang)。
4.1去垢劑去除柱（自備，貨號：DD0550）預處理：
4.1.1 取出柱子，放(fang)入套管(guan)中(zhong)。
4.1.2 旋(xuan)開管蓋，不要擰掉柱子底部堵頭，加入0.4 ml 1×PBS，蓋緊管蓋，常溫(wen)靜置2 min，活化填料。
4.1.3 擰掉柱(zhu)子(zi)底(di)部堵頭，將柱(zhu)子(zi)放入套管中，1000 g 離(li)心1
min，棄流穿液。
注：離(li)心力不(bu)要高(gao)于(yu)1000 g，過高(gao)的離(li)心力會損傷填料，降低(di)去垢劑(ji)去除效率。
4.1.4在柱(zhu)子(zi)管蓋上標記填料在柱(zhu)子(zi)內的(de)傾(qing)斜方向，隨后離心步驟均按(an)同一傾(qing)斜方向在離心機內放置柱(zhu)子(zi)。
4.1.5柱子(zi)中加入0.4 ml 1×PBS，1000 g 離心1min，棄流(liu)穿液。至此，柱子(zi)活化(hua)結束，備用(yong)。
4.2 樣品去垢劑去除：
4.2.1 將柱子轉移(yi)到2 ml尖底離(li)心管中，加入(ru)25-100 μl待處理樣品（樣品濃度高于(yu)0.5 μg/μl），常溫靜置2 min。
4.2.2 1000g 離心(xin)2 min，收集離心(xin)管內(nei)樣品。
5. 常見問題：
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常見問(wen)題
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可能原因
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解決(jue)方法
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蛋白提(ti)取得率低
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RL1080未能(neng)有效裂解細胞膜
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步(bu)驟(zou)2.2和(he)3.2修改為(wei)4度條(tiao)件下(xia)搖床持續混勻30min。
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RL1080使用量不夠
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加入(ru)更多的裂解液
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蛋白表達(da)量低
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優化轉染程序
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不能提取膜(mo)蛋(dan)白
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RL1080非(fei)變性裂(lie)解液僅能(neng)提取(qu)胞(bao)漿蛋白和(he)胞(bao)核(he)蛋白
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使用膜蛋白提(ti)取專用裂解緩沖(chong)液
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● 實驗示例：
實驗程序：
樣品提取：K562細胞 1×107細胞，400 g 離心3 min收集，1×PBS清洗2次，細胞沉淀中加入0.6 ml
非變性裂解液（貨號：RL1080），輕柔懸浮細胞，4度冰浴15min，間歇混勻，
4度 16000 g 15 min，收集上清。
電泳上樣樣品制備：BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度（貨號：RTP7102），
樣品加入4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號：PL114 ），調配為0.3 μg/μl上樣液，
上樣40 μl（12 μg）。
樣品1：RL1080提取樣品，加終濃度0.125% G-250（5% G-250染料，貨號：BC260）；
樣品2：RL1080提取樣品，不加G-250；
樣品3：RL1080提取樣品使用離心式去垢劑去除柱（貨號：DD0550）去除去垢劑，
樣品4：柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)（貨號:RTD8106）提取樣品；
凝膠制備：Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）（貨號：RTD6140）
制備10% 厚度1.5 mm凝膠；
電泳：使用10×BN電泳緩沖液（貨號：BC500P）。開始電泳用1×藍色BN電泳緩沖液（0.02%G250），
恒壓200 V 51min后，換無色1×BN 電泳緩沖液,電泳時間共104 min
凝膠預處理：凝膠浸泡于1×BN轉膜緩沖液+0.1%SDS中 搖床慢搖10 min
濕轉法轉膜：用10×BN轉膜緩沖液（貨號：BC600P）配制1×BN轉膜緩沖液+20%甲醇，用0.45 μm
PVDF，恒流200 mA（電壓變化114-83 V） 2小時，未冰浴（緩沖液水溫36度）。膜用無水甲醇去除藍色
封閉：Western快速封閉液（貨號：WR5020）快速封閉 10 min
GAPDH檢測：GAPDH 兔單抗（貨號：RGA1150） 1:10000 過夜孵育；
羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨號：HGR1020） RT 1h，ECL 1秒
抗體清除：PVDF膜用Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）（貨號：WS1200） 清除30min，
Western快速封閉液（貨號：WR5020）快速封閉 10min。
Lamin B1檢測：Anti-Lamin B1抗體（兔單抗）（貨號：RGL1150）1：3000 RT 1h，
羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨號：HGR1020） RT 1h，ECL 8秒