2×GC Buffer
● 產品組(zu)成：
|
目錄號
|
規格
|
價格
|
|
RTB3101-01
|
1ml
|
50元
|
|
|
|
|
|
RTB3101-03
|
10×1ml
|
300元(yuan)
|
● 保存(cun)：-20℃
● 用途：
PCR 擴增復(fu)雜(za)結構的 DNA 片段。
● 產(chan)品說明和注意事項：
1. 本產品能與各種PCR酶配(pei)合使用，能夠(gou)擴增(zeng)具有復雜二級(ji)結構(gou)模板（GC rich、重復序列等）的PCR片段。
2. 使用 GC Buffer 進(jin)行 PCR 擴增時，建議使用(yong) Tm 值較高的(de)引物。因此，引物最好設計在 30 mer 左右。
3. 使用(yong) GC Buffer擴(kuo)增的 GC rich 的DNA 片段長度，會(hui)因(yin) GC 含(han)量不(bu)同而各有(you)差異。
4. 由于 GC Buffer 和一般(ban)的(de)PCR Buffer 相比(bi) DNA 變性效果較強，因此，一(yi)般的 DNA片段（GC含量低(di)于(yu)50%的目的片(pian)段）不推薦(jian)使用2×GC buffer進行擴(kuo)增。
● 使用說明：
1.
按照下(xia)表在0.2ml
PCR管中制備反應體系：
|
成分
|
25μl反(fan)應體系
|
50μl反應體(ti)(ti)系
|
終(zhong)濃度
|
|
Template
|
0.05-0.5 μg
|
0.1-1 μg
|
as you wish
|
|
Primer 1（10
μM）
|
0.5 μl
|
1 μl
|
200nM
|
|
Primer 2（10
μM）
|
0.5 μl
|
1 μl
|
200nM
|
|
2×GC buffer
|
12.5 μl
|
25 μl
|
1×
|
|
dNTP Mixture(10 mM)
|
0.5 μl
|
1 μl
|
200μM each
|
|
Taq (5 U/μl)
|
0.25-0.5 μl
|
0.5-1 μl
|
2.5-5U
|
|
ddH2O
|
up to 25 μl
|
up to 50 μl
|
-
|
2. 混勻后，離心快甩將(jiang)反應液收集到管底。
3. PCR儀(yi)如果沒有熱蓋(gai)加熱的話，補加25μl礦物油。
4. PCR儀上執(zhi)行以(yi)下(xia)程序：
兩步法：
|
步驟
|
溫(wen)度
|
時間(jian)
|
循環(huan)數
|
|
初始(shi)變(bian)性(xing)
|
94℃
|
5 min
|
1
|
|
變性
|
94℃
|
30 sec
|
25-40*
|
|
退火和延伸
|
68℃
|
1 min/kb
|
|
最后延伸
|
72℃
|
5 min
|
1
|
*注： PCR 反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異。在實際操作中需根據模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長短等具體情況，設定最佳的反應條件（溫度、時間等）。
1. 怎樣(yang)確(que)定擴增片(pian)段的(de)GC含量大小？
推薦使用(yong)Oligo軟件分析片段的GC含量(如下圖所示)。
2.
2×GC
buffer能擴增正常GC含量片段嗎？
2×GC
buffer可以(yi)擴增GC含量正常的模(mo)板。然(ran)而，由于GC
buffer有比較(jiao)強的變(bian)性(xing)效果(guo)，因此一般的模(mo)板使用GC buffer擴(kuo)增(zeng)時(shi)，有時(shi)會降低擴(kuo)增(zeng)效率。
3.
2×GC
buffer能兼容大多(duo)數PCR用酶嗎？
2×GC
buffer能兼(jian)容大(da)多數PCR酶，比如Taq，Taq
plus，Long Taq等，可以(yi)根(gen)據片段長度以(yi)及保真性要求選擇不同的酶(mei)。
4. 使用GC
buffer擴(kuo)增時，為什么推薦使用兩步法？
由于目的片段GC含量高(gao)，引物的Tm值往(wang)往(wang)會(hui)比較高，在PCR時，當(dang)退火溫(wen)度和延伸溫(wen)度差距較小時，比如退火溫(wen)度超過60℃時，退火溫度和(he)延(yan)伸溫度可以(yi)設成同(tong)一數值，一般(ban)為68℃。
2×GC buffer
lane 1-5: Rice 390bp fragement(GC% 77.1%)
lane 6-10: Rice 760bp fragement(GC% 72.9%)
lane 1 and 6: TaKaRa 2×GC buffer I
lane 2 and 7: TaKaRa 2×GC buffer II
lane 3 and 8: RTB3101 2×GC buffer
lane 4 and 9: RTB3106 10×Taq PCR buffer
lane 5: Rice 390bp，RTB3101 2×GC buffer, 三步法(fa)擴增
lane 10: Rice 760bp，RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴增
