6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電(dian)泳試劑盒（變(bian)性電(dian)泳，手灌膠）
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貨號
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名稱(cheng)
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規格
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RTD6162
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6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電泳試劑盒（變性(xing)電泳，手(shou)灌膠）
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10次
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● 產品組成：
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貨號
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名稱
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規(gui)格
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貯(zhu)存
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RTD6162-UA
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上層膠溶液A
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10
ml
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4℃
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RTD6162-UB
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彩色(se)上層膠溶液B
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10
ml
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4℃
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RTD6162-LA06
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下層膠(jiao)溶液A 6%
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30
ml
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4℃
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RTD6162-LB
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下層(ceng)膠溶液B
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30
ml
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4℃
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RTD6162-SP
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改良型促凝劑
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8
ml
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4℃
(配制后-20℃貯(zhu)存)
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TA1510
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400×抗氧化劑
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15
ml
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4℃
(配(pei)制后-20℃貯存(cun))
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TA050
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10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液(變性電泳,溶液型）
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500
ml
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RT
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PL080-01
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5×MonoClolor蛋(dan)白上樣(yang)緩沖(chong)液 (變性，還原)
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1 ml
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-20℃
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RTD6202
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FastBlue蛋白快速染(ran)色(se)液
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500 ml
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RT
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TA5030P
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10×Tris-醋酸(suan)轉膜緩沖(chong)液（濕轉，粉末型(xing)）
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500
ml
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RT
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說明書
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一份
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-
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● 產品簡介：
Tris-醋酸-SDS-PAGE凝膠(jiao)電泳(yong)適合于分(fen)離(li)高(gao)分(fen)子量蛋白，可以有(you)效分(fen)離(li)50-500 kD范圍內蛋白；電泳(yong)體(ti)系呈中性，能有(you)效提高(gao)蛋白的(de)穩定(ding)性；電泳(yong)緩(huan)沖體(ti)系中加入抗氧化劑(ji)，整(zheng)個(ge)電泳(yong)過(guo)程(cheng)都(dou)在還原(yuan)條件下進(jin)行(xing)，有(you)效防(fang)止二硫鍵(jian)的(de)形成。
該試劑(ji)盒(he)包含凝膠(jiao)(jiao)(jiao)制(zhi)備、蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)上樣(yang)、蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)電泳、蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)染色及(ji)轉膜所需的全部(bu)試劑(ji)。試劑(ji)盒(he)配(pei)套的制(zhi)膠(jiao)(jiao)(jiao)溶液(ye)，可以(yi)配(pei)制(zhi)10板厚度(du)1mm凝膠(jiao)(jiao)(jiao)（面積8×10 cm），分離膠(jiao)(jiao)(jiao)濃(nong)(nong)度(du)為(wei)6%，可以(yi)有效分離50-500 kD范圍內蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)。配(pei)好的凝膠(jiao)(jiao)(jiao)濃(nong)(nong)縮膠(jiao)(jiao)(jiao)為(wei)紅色，方便上樣(yang)。本(ben)試劑(ji)盒(he)用(yong)于(yu)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)變性還原電泳，不適用(yong)于(yu)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)非變性電泳。
按照一次實驗電泳一板凝(ning)膠計算，本試劑(ji)盒可以使用10次。
● 貯存、運輸及效期：
按照標(biao)簽溫度貯存(cun)；試劑盒(he)常溫運輸；有效(xiao)期一年(nian)。
● 使用說明：
一. 實驗準備：
1.1 改良型(xing)促(cu)凝(ning)劑(ji)(ji)為干粉，用(yong)(yong)前(qian)加入(ru)8 ml超純水震(zhen)蕩徹底溶解，適量分裝后取一管使(shi)用(yong)(yong)。溶解后的(de)促(cu)凝(ning)劑(ji)(ji)-20℃貯存。
1.2 400×抗(kang)氧(yang)化(hua)劑為干粉(fen)，用前加入15 ml超純水震(zhen)蕩(dang)徹底溶(rong)解后(hou)使用，已(yi)經溶(rong)解的400×抗(kang)氧(yang)化(hua)劑-20℃貯存(cun)。
二. 凝膠配制：
2.1參照凝膠模具說明書，裝(zhuang)配(pei)好(hao)凝膠模具。
2.2 根據下表配制凝(ning)膠(jiao)：
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下層膠(jiao)配方
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上層膠(jiao)配方(fang)
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膠厚度
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下層(ceng)膠(jiao)溶(rong)液B
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下層膠溶液A
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改(gai)良型促凝(ning)劑(ji)
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膠厚度
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彩色上層膠溶液(ye)B
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上層膠溶(rong)液A
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改良型促(cu)凝(ning)劑
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0.75 mm
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2 ml
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2 ml
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40 μl
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0.75 mm
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0.5 ml
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0.5 ml
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10 μl
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1.0 mm
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2.5 ml
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2.5 ml
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50 μl
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1.0 mm
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0.75 ml
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0.75 ml
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15 μl
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1.5 mm
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4 ml
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4 ml
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80 μl
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1.5 mm
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1 ml
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1 ml
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20 μl
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2.2.1 取等體積下(xia)層膠(jiao)溶液B 和下(xia)層膠(jiao)溶液A ，各(ge)
2.0/2.5/4.0 ml，混勻；
2.2.2混(hun)(hun)合溶液(ye)中加入(ru) 40/50/80 μl的改(gai)良型促凝劑，輕輕混(hun)(hun)勻，將混(hun)(hun)勻后的溶液(ye)注(zhu)入(ru)制膠玻璃板中，使液(ye)面(mian)和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長0.5 cm即可；
注意：此溶液為過量，請勿全部注入。
2.2.3 沿玻璃(li)板緩(huan)慢加入適量滅菌水或無水乙醇覆(fu)蓋于(yu)下(xia)層膠(jiao)之上，待下(xia)層膠(jiao)凝固(gu)后，倒去上層水或乙醇；
注意：當水（乙醇）和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝固；25℃時5-10分鐘可以聚合。
2.2.4 取等體積彩色上層膠溶液B和上層膠溶液A ，各
0.5/0.75/1.0 ml，混勻；
2.2.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑，輕輕混勻，插入梳齒；
2.2.6 待上層膠凝固后 （約20-40
min），拔去梳(shu)齒即(ji)可用(yong)于電泳。
注：凝膠的聚合(he)時(shi)(shi)(shi)(shi)間與環境溫度有(you)關(guan)。夏天(tian)溫度較(jiao)高(gao)時(shi)(shi)(shi)(shi)，聚合(he)較(jiao)快；冬(dong)天(tian)氣溫低時(shi)(shi)(shi)(shi)，聚合(he)時(shi)(shi)(shi)(shi)間會延長。
上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚合；18℃ 35-40分鐘可以聚合。
三. 電泳：
3.1 準備1×電泳緩沖液：
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總體積
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1000
ml
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10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液(ye)
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100 ml
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超純水
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900 ml
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3.1.1 外槽緩(huan)(huan)沖(chong)液：取適量(liang)體積1×電(dian)泳緩(huan)(huan)沖(chong)液用于外槽緩(huan)(huan)沖(chong)液。
3.1.2 內槽緩沖(chong)液：200 ml 1×電泳緩沖(chong)液中加0.5 ml 400×抗氧化劑，混合(he)均勻后用于(yu)內槽緩沖(chong)液。
3.2準備上樣樣品：
注：表格以配制10 μl樣品為例，其他體積按照比例調整。
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總體積10 μl
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組(zu)份
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還原(yuan)樣品
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蛋白(bai)樣(yang)品
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x μl
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5×MonoClolor蛋白上樣緩沖液(ye) (變(bian)性(xing)，還原)
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2 μl
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超純水
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補至10 μl
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95℃ 10分(fen)鐘
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3.3電泳過程；
在電泳(yong)槽(cao)的(de)內(nei)槽(cao)加入(ru)內(nei)槽(cao)緩沖液(ye)（已(yi)加入(ru)抗氧(yang)化劑），讓(rang)電泳(yong)緩沖液(ye)漫(man)過(guo)加樣孔，輕輕的(de)撥出梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次；隨后在電泳(yong)槽(cao)外槽(cao)加入(ru)適(shi)量(liang)的(de)外槽(cao)緩沖液(ye)（不用添加抗氧(yang)化劑）。上樣，電泳(yong)。
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恒電壓(ya)
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起始電流
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結束(shu)電流
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電泳時間
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200
V
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65-75 mA/板膠
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35-55 mA/板膠(jiao)
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50+min
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注(zhu)：冰浴電泳（可選）
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四. 染色：
注：如果只是觀察蛋白的分離情況，對凝膠進行染色。如果要后續進行WB實驗，凝膠不要染色，進行步驟五。
4.1 將電泳后的(de)PAGE膠取下放入塑(su)料(liao)容器中，加入適量FastBlue蛋(dan)白染色液(ye)（以剛剛覆蓋過膠面(mian)為適），搖床常溫搖動，條帶5-10分鐘即可見（蛋(dan)白含(han)量高于1
μg條帶）。
4.2 搖床常溫繼續搖動15-30分鐘至條(tiao)帶清(qing)晰可見。
4.3 加入適量蒸(zheng)餾水脫色(se)，期(qi)間更換1-2次(ci)蒸(zheng)餾水，搖床(chuang)常溫搖動10-15分(fen)鐘至背景干(gan)凈。
4.4 觀察保存結果。
五. 轉膜：
5.1 轉印膜選擇：
Tris-醋酸凝(ning)膠(jiao)轉膜可以使用NC膜和(he)PVDF膜，需要選擇0.45 μm孔(kong)徑。PVDF膜使用前注(zhu)意需要用甲醇(chun)潤濕活(huo)化。
5.2 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型）配制：
將10×Tris-醋酸轉膜緩沖(chong)液(ye)(ye)（濕轉，粉末(mo)型(xing)）粉末(mo)溶(rong)解(jie)于500 ml超純水中，即配成500 ml 10×Tris-醋酸轉膜緩沖(chong)液(ye)(ye)（溶(rong)液(ye)(ye)型(xing)），不要調節(jie)pH，pH~7.2。
5.3 準備1×轉膜緩沖液：
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1×即用(yong)型轉膜緩沖液 配制量(liang) 1升
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10×Tris-醋酸轉膜緩(huan)沖液(溶液(ye)型)
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100
ml
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20-80 kD蛋白
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無水甲醇
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10%
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SDS
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0.05%
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＞80 kD蛋(dan)白(bai)
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無(wu)水(shui)甲醇
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10%（NC膜）
0-5%（PVDF膜）
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SDS
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0.1%
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超純水
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定容至1升(sheng)，不(bu)要調(diao)節pH，pH~7.2
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注：甲醇(chun)和SDS在(zai)轉(zhuan)膜中(zhong)有拮抗作用。甲醇(chun)使蛋(dan)白(bai)更加(jia)(jia)結合在(zai)膜上，而(er)SDS讓蛋(dan)白(bai)更加(jia)(jia)離開膜。因(yin)此對大蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)膜來(lai)說，多加(jia)(jia)SDS，少(shao)加(jia)(jia)甲醇(chun)；而(er)對小蛋(dan)白(bai)轉(zhuan)膜，多加(jia)(jia)甲醇(chun)，少(shao)加(jia)(jia)SDS。
5.4 轉膜條件：
高分(fen)子量蛋白建議濕轉(zhuan)。以下(xia)轉(zhuan)膜條件僅供參考，客戶針對自(zi)己的(de)(de)目的(de)(de)蛋白，最好經過(guo)1-2次(ci)預實驗后，確定(ding)最佳的(de)(de)轉(zhuan)膜條件。
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膜(mo)孔徑(jing)
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蛋(dan)白(bai)大(da)小(xiao)
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穩流
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建議(yi)時間
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降(jiang)溫措施(shi)
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0.45 μm
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50-200 kD
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350 mA
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~60分鐘
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需要(yao)
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0.45 μm
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高于(yu)200
kD
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350 mA
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~2-3小時
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需要
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六. 實驗示例：
凝膠：6%Tris醋酸手灌膠
電泳：1×TAS 200V 70-42mA 55min；內槽加抗氧化劑
染色：FastBlue蛋白染色液染色 15 分鐘
樣品：4K-BME-細菌裂解物；K562-懸浮細胞RIPA提取總蛋白