快速蛋白高靈敏(min)度染色試劑盒
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產品編號
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規格(ge)
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貯存(cun)
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RTD6401
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25次
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常溫(wen)
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● 貯存、運輸(shu)及(ji)效期：
常(chang)溫(wen)保存；常(chang)溫(wen)運輸(shu)；開封后一年(nian)有(you)效。
● 產品簡介
快(kuai)速(su)(su)蛋(dan)白(bai)(bai)高(gao)靈敏度(du)(du)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)是一(yi)種快(kuai)速(su)(su)簡單、可用(yong)(yong)于(yu)SDS-PAGE或(huo)非變(bian)性PAGE等蛋(dan)白(bai)(bai)分(fen)離(li)后染色的(de)(de)(de)試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)。本試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)也可以(yi)(yi)用(yong)(yong)于(yu)2D凝(ning)膠的(de)(de)(de)染色，并(bing)且染色后兼(jian)容(rong)后續的(de)(de)(de)質譜(pu)檢測(ce)。本試(shi)(shi)劑(ji)盒(he)(he)只需(xu)約90分(fen)鐘內可以(yi)(yi)完成凝(ning)膠的(de)(de)(de)染色。對(dui)于(yu)BSA蛋(dan)白(bai)(bai)，檢測(ce)靈敏度(du)(du)可以(yi)(yi)達(da)到0.3 ng蛋(dan)白(bai)(bai)。
本試(shi)劑盒可足夠用于25塊常規的8×10 cm凝(ning)膠的染色(se)。
說明書后附(fu)有實驗記(ji)(ji)錄(lu)表(biao)格，方(fang)便(bian)記(ji)(ji)錄(lu)實驗步(bu)驟(zou)。
● 產品組成：
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產(chan)品編號
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產(chan)品(pin)名稱
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規格(ge)
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貯存
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RTD6401-1
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增敏液(100×)
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26 ml
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常溫
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RTD6401-2
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染色溶(rong)液(ye)(100×)
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26 ml
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常(chang)溫，避光
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RTD6401-3
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基本顯色液(10×)
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250 ml
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4℃
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RTD6401-4
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顯(xian)色加速液(2000×)
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1.5 ml
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常溫，避光
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RTD6401-5
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終止液(20×)
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125 ml
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常溫(wen)
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● 注意事項：
1. 由于(yu)該方法染(ran)色非常靈(ling)敏，操作(zuo)時(shi)請(qing)注意盡量使用高(gao)純度的(de)水，并確保(bao)所使用的(de)器皿(min)非常清潔(jie)，最好使用潔(jie)凈的(de)玻璃器皿(min)。操作(zuo)時(shi)必須戴(dai)手套(tao)，避免皮膚(fu)和凝膠直接接觸。
2. 需自備乙醇、冰(bing)醋酸(suan)及(ji)MilliQ級純水或雙蒸水。
3. 下述(shu)使(shi)用(yong)說(shuo)明中各(ge)種溶液的(de)使(shi)用(yong)量適用(yong)于大小為(wei)(wei)8×10
cm厚(hou)(hou)度(du)為(wei)(wei)0.75-1 mm的(de)凝膠。對于更大的(de)凝膠，各(ge)種溶液的(de)使(shi)用(yong)量需(xu)按(an)(an)凝膠面積的(de)比(bi)例放大；對于更厚(hou)(hou)的(de)凝膠，作(zuo)用(yong)時間需(xu)按(an)(an)照厚(hou)(hou)度(du)的(de)比(bi)例適當延長(chang)10-20分(fen)鐘。
4. 本說明書所指的(de)常溫(wen)溫(wen)為20-25℃，操(cao)作溫度較低時由于溶(rong)液的擴散(san)能力下降，各(ge)步驟需(xu)適當(dang)延長時間。
5. 基本顯色液(10×)在(zai)4℃低(di)溫貯存時可(ke)能會出現(xian)沉淀，可(ke)在(zai)37℃水浴(yu)中溶解，并(bing)充分混(hun)勻(yun)后使用。
● 使(shi)用方法：
一. 固定步驟：
1.1 漂洗(xi)：電泳結束后，凝(ning)膠(jiao)中加入(ru)100 ml雙蒸(zheng)水中漂洗(xi)5分鐘，重(zhong)復漂洗(xi)1次，去除凝(ning)膠(jiao)表面的(de)電泳緩(huan)沖液。
1.2 固(gu)定(ding)(ding)：取漂洗后的凝(ning)膠放入約(yue)100 ml固(gu)定(ding)(ding)液中，在搖(yao)(yao)床上常溫搖(yao)(yao)動20分鐘(zhong)，搖(yao)(yao)動速度為60-70 rpm。固(gu)定(ding)(ding)40分鐘(zhong)以上甚至過夜(ye)可以進一步降低背(bei)景。
固定液的配制(zhi) 配制量100 ml
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無水乙醇
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冰醋酸
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超純水
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50 ml
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10 ml
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40 ml
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1.3
30%乙醇(chun)洗滌：
棄(qi)固(gu)定(ding)液(ye)，加入100 ml 30%乙醇，在搖床上(shang)常溫搖動(dong)10分鐘，搖動(dong)速度為60-70 rpm。
30%乙醇的配(pei)制：
70 ml MilliQ級(ji)純(chun)水或雙(shuang)蒸水中加入30 ml乙醇(chun)，混勻后即(ji)成(cheng)100 ml 30%乙醇(chun)。
1.4 水漂洗：
棄30%乙醇，加入100 ml MilliQ級純水(shui)或雙蒸水(shui)，在搖床上常(chang)溫搖動(dong)5分鐘，搖動(dong)速度為60-70 rpm；重復漂洗一次。
二. 增敏步驟：
2.1 棄水，加(jia)入(ru)100 ml增敏(min)液(1×)，在(zai)搖床上常(chang)溫搖動(dong)2分鐘(zhong)，搖動(dong)速度為60-70 rpm。
增敏液(1×)的(de)配(pei)制：
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增(zeng)敏液(100×)
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超純水
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1 ml
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99 ml
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注(zhu)：增(zeng)敏液(ye)(1×)配制后需在2小時內使用。
2.2 水(shui)漂洗(共2次(ci))：
棄原有溶液，加入(ru)200 ml MilliQ級純水或雙(shuang)蒸水，在(zai)搖床上常溫搖動(dong)1分(fen)鐘，搖動(dong)速度為60-70 rpm。 重復(fu)此步(bu)驟一次。
三. 染色步(bu)驟(zou)：
3.1 染(ran)色：
棄水，加入100 ml染(ran)色溶液(1×)，在搖床上常溫搖動(dong)10分鐘，搖動(dong)速度(du)為60-70 rpm。 染(ran)色過程中，凝膠會呈微微黃色。
染色溶液(1X)的配制(zhi)：
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染色液(100×)
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超(chao)純水
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1 ml
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99 ml
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注：染色溶液(1X)配制后(hou)需在2小時內使用(yong)。
3.2 水洗(xi)滌：
棄染色溶(rong)液，加入100 ml MilliQ級純水或雙(shuang)蒸水，在搖(yao)床上常溫搖(yao)動(dong)1-1.5分鐘，搖(yao)動(dong)速度為60-70rpm。
注意：水洗滌的時間(jian)不(bu)能超過1.5分鐘(zhong)。
四. 顯(xian)色步驟：
棄水，加入100 ml顯色(se)液，在(zai)搖床(chuang)上常溫搖動3-7分鐘，直至出(chu)現(xian)比(bi)較理想的(de)預期蛋白條(tiao)帶(dai)，搖動速度為60-70 rpm。
顯色液的配制 配制量100 ml
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基本(ben)顯色液(10×)
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超(chao)純水
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顯色加(jia)速液(2000×)
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10 ml
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90 ml
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50 μl
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注：顯色加速(su)液(2000×)有刺激性氣味，建議在通(tong)風櫥內(nei)操作；
顯色(se)液(ye)配制后需在20分鐘內使用(yong)。
五. 終止步驟(zou)：
5.1 漂(piao)洗：棄顯(xian)(xian)色液(ye)，加入100 ml雙蒸水在搖(yao)床上常溫搖(yao)動(dong)2分(fen)鐘，漂(piao)洗掉凝膠上殘留的(de)顯(xian)(xian)色液(ye)。
5.2 終止染色(se)：
棄顯色液(ye)，加入100 ml終止液(ye)(1×)，在(zai)搖床上常(chang)溫搖動(dong)10分鐘，搖動(dong)速度為60-70 rpm。終止時有氣(qi)(qi)體產生(sheng)(sheng)屬正(zheng)常(chang)現象(xiang)，產生(sheng)(sheng)的(de)氣(qi)(qi)體為二氧化碳(tan)。
終止液(1×)的配(pei)制(zhi)：
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終(zhong)止(zhi)液(20×)
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超純水
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5 ml
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95 ml
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注：終止液(1×)配制(zhi)后應當天使用。
5.3 水洗滌(di)：
棄終止液，加入100 ml MilliQ級純(chun)水(shui)或雙蒸水(shui)，在搖床上常溫搖動(dong)5分鐘，搖動(dong)速度為60-70 rpm。
六. 保存：
可在(zai)MilliQ級純水(shui)或雙蒸(zheng)水(shui)中保存或采(cai)用(yong)適當的方式制備成干膠(jiao)。
● 常見問(wen)題：
一(yi). 背景太深：
1.1. 步(bu)驟四顯色時間過(guo)長(chang)。通常顯色反應會在10分鐘(zhong)內結束，顯色反應時間過(guo)長(chang)會導致(zhi)背景很(hen)深(shen)。
1.2. 洗滌(di)不充分。洗滌(di)時(shi)間過短，或(huo)洗滌(di)液加入(ru)的(de)量(liang)不足，或(huo)者(zhe)容器過于狹小導致(zhi)搖動時(shi)溶(rong)液不易充分混合，或(huo)搖動速度過慢，導致(zhi)混勻不充分。請按照說(shuo)明書的(de)建議確保各種溶(rong)液的(de)用(yong)量(liang)和(he)作用(yong)時(shi)間，搖床(chuang)的(de)推薦速度為(wei)60-70 rpm。
1.3 步(bu)(bu)驟1.2中(zhong)凝膠中(zhong)原有的(de)(de)(de)緩沖(chong)液等未(wei)在固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)步(bu)(bu)驟中(zhong)去除干凈。一方面需確(que)保固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)的(de)(de)(de)時(shi)間和固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)液的(de)(de)(de)用(yong)量，另一方面對于(yu)不是最常用(yong)的(de)(de)(de)Bis-Tris系統的(de)(de)(de)凝膠需要更長的(de)(de)(de)固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)時(shi)間以充分去除凝膠中(zhong)的(de)(de)(de)原有緩沖(chong)成分，以降低背景。
1.4
水的純(chun)(chun)度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高(gao)純(chun)(chun)度水。
二(er). 蛋(dan)白條帶非常淺(qian)：
2.1 蛋白的(de)(de)半胱氨酸(Cysteine)殘(can)基的(de)(de)含(han)量(liang)特別低或幾乎沒有。半胱氨酸殘(can)基的(de)(de)存(cun)在(zai)對于染(ran)色非常重要(yao)，半胱氨酸殘(can)基的(de)(de)含(han)量(liang)過低會導(dao)致(zhi)檢測靈敏度下(xia)降。
2.2 步(bu)驟3.2染色后(hou)水(shui)(shui)洗(xi)滌時(shi)間(jian)(jian)過長。在染色溶(rong)液染色時(shi)需嚴格控制水(shui)(shui)洗(xi)滌的(de)時(shi)間(jian)(jian)，水(shui)(shui)洗(xi)滌的(de)時(shi)間(jian)(jian)不能超過1.5分鐘，否則會導致(zhi)過(guo)多(duo)的(de)顯色(se)離子被洗去，導致(zhi)檢測靈敏度下(xia)降。
2.3 上樣量不(bu)足。本試劑盒檢測BSA的(de)靈敏(min)度可以達到0.3
ng，對(dui)于不(bu)同(tong)的(de)蛋白檢測靈敏(min)度可能不(bu)同(tong)。對(dui)于一些蛋白可能需要(yao)大于1 ng的(de)蛋白量才能被檢測到。
2.4步驟1.3和(he)1.4的洗滌不夠充分(fen)。導致少(shao)量(liang)乙(yi)酸殘留(liu)，影(ying)響后續檢測。確保30%乙(yi)醇洗滌和(he)水洗滌的用量(liang)和(he)時(shi)間，可以(yi)適當延(yan)長洗滌時(shi)間。
三. 凝膠(jiao)上出現小點或其(qi)它非蛋白的痕跡：
3.1 凝(ning)膠沒有充分被(bei)溶(rong)液(ye)浸沒。請注意選擇大小合適(shi)的容器，并加入足量的各種溶(rong)液(ye)，同時需(xu)保持適(shi)當的混勻速度確保凝(ning)膠可以被(bei)溶(rong)液(ye)浸沒。
3.2 用于染色(se)(se)的容(rong)器沒有充分洗滌(di)(di)干凈。容(rong)器需先用洗滌(di)(di)劑充分洗滌(di)(di)，隨后(hou)用自來水充分沖洗，最后(hou)用高純(chun)度水再(zai)洗滌(di)(di)數次。該容(rong)器最好能專用于染色(se)(se)，并注意避免(mian)各種可能的蛋白(bai)污染。
3.3 指紋或其它壓痕。請注(zhu)意(yi)戴(dai)手套(tao)操(cao)作，切勿直接接觸皮膚。操(cao)作時請注(zhu)意(yi)盡量勿擠壓、
折疊或摩擦凝膠。
3.4 有金(jin)屬(shu)物質接觸(chu)凝膠。金(jin)屬(shu)物質例(li)如(ru)金(jin)屬(shu)鑷(nie)子等(deng)接觸(chu)凝膠會出(chu)現非特(te)異性痕跡。
四. 在(zai)60-70 kD處出現一片模糊(hu)的蛋白染色背景：
皮膚上脫落的(de)角蛋(dan)白(keratin)污染了(le)蛋(dan)白樣品(pin)。一方(fang)面需注意戴手套(tao)操作，另一方(fang)面需注意盛放(fang)蛋(dan)白樣品(pin)的(de)容器(qi)蓋(gai)子盡量(liang)不要敞開，甚(shen)至在(zai)取(qu)放(fang)蛋(dan)白樣品(pin)時在(zai)超凈臺(tai)內(nei)進行(xing)以避免可能的(de)角蛋(dan)白污染。
五. 在凝膠的上(shang)半部分出現黃(huang)色(se)背(bei)景：
5.1 樣品使(shi)用了(le)含有DTT的上樣緩沖液(ye)。換(huan)用含有其它還原試劑如β-巰基乙醇的上樣緩沖液(ye)。
5.2 采用Tris-Glycine-SDS電泳體(ti)系(xi)。Tris-Glycine-SDS電泳體(ti)系(xi)中(zhong)的Glycine會導致
背景(jing)凝膠的頂端出(chu)現輕微的黃色背景(jing)。
● 實驗記錄表格
實驗日期(qi)：
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約90分鐘
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標記√
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起始時間
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一(yi) 固定步驟
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1.1 水漂洗
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2×5 min
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1.2 固定
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20 min
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1.3 乙醇漂(piao)洗
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10 min
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1.4水漂洗
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2×5 min
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二 增敏步驟
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2.1 增敏
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2 min
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2.2 水漂洗
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2×1 min
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三 染色(se)步驟
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3.1染色
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10 min
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3.2水漂洗
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＜1.5 min
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四(si) 顯(xian)色(se)步驟
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顯(xian)色
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3-7 min
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五 終止(zhi)步驟
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5.1 水漂洗(xi)
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2 min
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5.2 終止(zhi)
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10 min
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5.3 水漂洗
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5 min
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六(liu) 保存
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實驗示例：
使用快速蛋白高靈敏度染色試劑盒 RTD6401發表部分文章列表：
1. [2022 IF=4.8] Reassortment and genomic
analysis of a G9P[8]-E2 rotavirus isolated in China.
Author: Rui Peng, Dandi Li, Jindong Wang,
Guangping Xiong , Mengxuan Wang, Dan Liu, Yuhang Wei, Lili Pang, Xiaoman Sun,
Huiying Li, Xiangyu Kong, Saleha Shahar, Zhaojun Duan.
Product: RTD6401 快速蛋白高靈敏度染色試劑盒
Journal: Virology Journal 2023 Jun 22;20(1):135.
Institution：Universiti Teknologi Malaysia
Paper link：