柱式動(dong)物胞漿蛋白提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)
(Column Animal
Cells Native Protein Extraction Kit，Detergent-free)
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貨號
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名稱
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規(gui)格
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RTD8106
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柱式動(dong)物(wu)胞(bao)漿蛋白提取試劑盒(細胞(bao)樣品,非變性提(ti)取,不含(han)去垢劑)
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50次
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● 產(chan)品簡(jian)介
蛋(dan)白(bai)提取(qu)過程中(zhong)經常(chang)使用去垢(gou)(gou)劑(ji)裂解細胞，如NP-40，Triton
X-100，SDS等。然而這些去垢(gou)(gou)劑(ji)會對提取(qu)的(de)蛋(dan)白(bai)后續功(gong)能研究(jiu)產生影(ying)響。如去垢(gou)(gou)劑(ji)會影(ying)響蛋(dan)白(bai)的(de)熒(ying)光標記；高(gao)濃度的(de)去垢(gou)(gou)劑(ji)會影(ying)響蛋(dan)白(bai)互作(zuo)研究(jiu)；陰(yin)離子(zi)去垢(gou)(gou)劑(ji)如SDS提取(qu)得到變性蛋(dan)白(bai)，不利于(yu)蛋(dan)白(bai)活性研究(jiu)；含去垢(gou)(gou)劑(ji)的(de)蛋(dan)白(bai)樣品能與考馬斯亮藍G-250結合，影(ying)響Blue
Native電泳的(de)分離效果。
本試(shi)劑(ji)盒采用不含去垢劑(ji)的裂(lie)解緩(huan)沖液，在低滲透壓(ya)條件下，使細(xi)胞(bao)充(chong)分膨(peng)脹，然后(hou)結合離(li)心柱離(li)心，有效(xiao)(xiao)破壞細(xi)胞(bao)膜，釋放出(chu)細(xi)胞(bao)內蛋白(bai)(bai)，然后(hou)通過離(li)心得到活性蛋白(bai)(bai)。另外，裂(lie)解緩(huan)沖液中也不含有還原劑(ji)如(ru)DTT和(he)BME等，能有效(xiao)(xiao)保持蛋白(bai)(bai)的天然結構。
對于(yu)細胞樣(yang)品，如果每個樣(yang)品的數量為5×106個(ge)細(xi)胞，本試(shi)劑盒(he)可以(yi)抽提50個(ge)樣(yang)品。
使(shi)用該產(chan)品(pin)提取(qu)的(de)蛋白可(ke)以用于普通(tong)非變性(xing)電泳(yong)（Laemmli系(xi)統）（貨(huo)號(hao)：RTD6130，RTD6135）或Blue
Native系(xi)統（貨(huo)號(hao)：RTD6140）。
注：由于提(ti)取緩沖液的(de)適用性(xing)，本試劑盒主要提(ti)取得到的(de)是胞漿(jiang)內的(de)可溶性(xing)蛋白，對細胞膜蛋白，細胞器蛋白，細胞核蛋白提(ti)取效率(lv)不高，不建議使(shi)用。
● 產品(pin)組成
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產品(pin)編號
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名(ming)稱
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規(gui)格
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貯存(cun)
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RTD8106-01
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非變(bian)性裂解緩沖(chong)液
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25 ml
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4℃
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CD-50
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離心柱(zhu)套裝(zhuang)
（包含離心柱和(he)2ml連蓋(gai)收集管）
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50個
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RT
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● 貯存、效期(qi)及(ji)運(yun)輸：
按照標簽溫(wen)度貯存；有效期一(yi)年；常(chang)溫(wen)運輸。
● 用前必讀(du)：
1.
離(li)(li)心(xin)(xin)機(ji)請調整成RCF/g模式(shi)(shi)，按照(zhao)離(li)(li)心(xin)(xin)力設置(zhi)離(li)(li)心(xin)(xin)機(ji)（不要(yao)根據轉速(su)rpm模式(shi)(shi)設置(zhi)），所有離(li)(li)心(xin)(xin)步驟都需(xu)要(yao)在4℃低溫離(li)(li)心(xin)(xin)機(ji)中進(jin)行。
2.
溶液(ye)混勻后放(fang)置于冰上。將離(li)心(xin)柱套(tao)入2
ml連蓋收集管(guan)中，蓋好管(guan)蓋，放(fang)置于冰上預冷。
3.
蛋白(bai)提取推薦添(tian)加蛋白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)（自備，試(shi)劑(ji)盒不提供），根據蛋白(bai)酶抑(yi)制劑(ji)母(mu)液(ye)濃(nong)度提前添(tian)加在裂(lie)解緩(huan)沖液(ye)中（添(tian)加時按照1:100添(tian)加，即1ml裂(lie)解緩(huan)沖液(ye) 添(tian)加10
μl抑(yi)制劑(ji)）。研究蛋白(bai)磷酸化，需要添(tian)加磷酸酶抑(yi)制劑(ji)（自備，試(shi)劑(ji)盒不提供）。
4.
蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選(xuan)擇BCA蛋白濃度測定試(shi)劑盒（貨(huo)號：RTP7102）。
● 使用方法(fa)：
一(yi) 培(pei)養細胞活性蛋白提(ti)取：
1.1 即(ji)用型裂解緩沖液配制：
取(qu)適(shi)當體積的預冷裂(lie)解緩沖液，在使用前(qian)數分鐘(zhong)內加入1/100體積的蛋白酶抑制劑（100×）（自(zi)備(bei)(bei)，試(shi)劑盒(he)不(bu)提(ti)供(gong)），如果進行蛋白磷酸(suan)化研究(jiu)，需(xu)要加入1/100體積的磷酸(suan)酶抑制劑（100×）（自(zi)備(bei)(bei)，試(shi)劑盒(he)不(bu)提(ti)供(gong)），隨后立即(ji)放于冰上待用（30分鐘(zhong)內使用）。
按照下(xia)表大(da)體估算(suan)裂解緩沖液使用體積：
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細胞類型(xing)
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培養(yang)器(qi)皿(min)
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細胞(bao)數量
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細(xi)胞沉淀體(ti)積（PCV）（μl）
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裂解緩沖液（μl）
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懸浮細(xi)胞(bao)
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2-5×106
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20-50
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200
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5-10×106
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＞50
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500
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貼(tie)壁細(xi)胞(bao)
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96孔(kong)板
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~1×105
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調(diao)整(zheng)細(xi)胞數目到2-5×106
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200
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24孔板
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~5×105
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調整細胞(bao)數(shu)目到2-5×106
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200
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6孔(kong)板
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~2.5×106
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~25
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200
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25cm2培(pei)養瓶(ping)
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~2×106
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~20
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200
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75cm2培養瓶
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~8×106
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~80
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500
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35
mm培(pei)養皿
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~2×106
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~20
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200
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60
mm培養皿
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~5×106
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~50
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500
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100
mm培養皿
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~1.5×107
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調整細(xi)胞數(shu)目到2-5×106
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200
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注：
(二百(bai)萬，2×106)HeLa細(xi)胞，其(qi)細(xi)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
1.2 準備細(xi)胞(bao)：
1.2.1
對于貼壁細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)：細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)用(yong)PBS漂洗一(yi)遍，棄PBS；再加入適量PBS，用(yong)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)刮(gua)刀(dao)刮(gua)下細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，或用(yong)0.02%
EDTA（0.5
mM）溶(rong)液處(chu)理細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)使細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)不再貼壁很緊，并用(yong)移液器吹打下細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。400
g（~2000
rpm）
4℃離心5
min收集細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，盡最大努力吸(xi)盡上清，留下細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)沉淀備用(yong)。盡量避免(mian)用(yong)胰(yi)酶消化細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，以(yi)免(mian)胰(yi)酶降(jiang)解(jie)需(xu)抽(chou)提的(de)目的(de)蛋白(bai)。
1.2.2
對于懸浮細胞(bao)：400
g（~2000
rpm）4℃離心5
min收(shou)(shou)集細胞(bao)，用PBS洗一遍(bian)，離心收(shou)(shou)集細胞(bao)，盡最大(da)努力吸盡上清，留下細胞(bao)沉淀備用。
1.3 裂解細胞膜：
1.3.1細胞沉淀(dian)中(zhong)加入準備好的裂解緩沖液(ye)（含(han)蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制劑），用移液(ye)器吹打重懸細胞沉淀(dian)，渦旋劇烈震蕩30-60秒(miao)，冰浴處理10分鐘(zhong)，間歇2-3次混(hun)勻。
注：裂解緩沖液使用推(tui)薦經驗值：起始細胞數低于5×106加入(ru)
200 μl 裂解緩(huan)沖液，起始(shi)細胞數在5×106-1×107之間加入(ru)500
μl。如果(guo)細(xi)胞數目低于1×106或高(gao)于1×107，建議調整細胞數目在2-5×106范圍(wei)內。
1.3.2
將細胞(bao)懸液轉移到離心柱中，蓋上管(guan)蓋，16,000
g（~13000
rpm）
4℃離心1分鐘(zhong)，離心后可見收集管(guan)底部(bu)有沉(chen)淀形(xing)成。
注：離心(xin)柱(zhu)最大(da)體積為600 μl；確(que)保離心(xin)機轉(zhuan)速可以在1分(fen)鐘內(nei)升(sheng)速到16000 g。
1.3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收(shou)集(ji)管管蓋，用1ml移(yi)液器輕柔(rou)吹打重懸收(shou)集(ji)管中的沉(chen)淀。
1.4 去除細胞(bao)核和未破碎的細胞(bao)：
將懸浮溶液16000 g（~13000 rpm）
4℃離心15分鐘。
1.5 收集上清：
收集上清即為胞(bao)漿蛋白，其蛋白濃度約為0.5-2 μg/μl，不(bu)同(tong)(tong)細胞(bao)略(lve)有不(bu)同(tong)(tong)。
關鍵(jian)步驟：吸取(qu)上(shang)清(qing)時不(bu)要觸及(ji)沉淀，甚(shen)至可(ke)以(yi)丟棄部分上(shang)清(qing)不(bu)吸取(qu)，以(yi)免(mian)上(shang)清(qing)中污染其他蛋白。
二 實驗示例：
2.1 電泳檢測：
5×106 K562細(xi)胞(bao)，400g 3min收集，PBS漂洗一次；加500 μl 即(ji)用型提取緩沖液（含(han)蛋白(bai)(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)），震蕩(dang) 60秒，冰(bing)浴(yu)10min；16000g 1min 過(guo)離心柱；重懸(xuan)沉淀；4度(du) 16000g 15 min，取上清(qing)即(ji)為(wei)胞(bao)漿活性蛋白(bai)(bai)。BCA測定蛋白(bai)(bai)濃度(du)，蛋白(bai)(bai)得率2×108細胞提取蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)量約(yue)1.5 mg。BN電(dian)泳（右圖）：RTD6140 配制10% BN膠。使(shi)(shi)用(yong) 4×BN蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)上樣緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)（貨號：PL114）調(diao)整上樣濃度為(wei)0.5μg/μl。1×藍色陰極(ji)電(dian)泳緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye) 200V 50min，更換(huan)為(wei)1×無色陰極(ji)緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)，電(dian)泳時間共93min，FastBlue蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)染(ran)色液(ye)(ye)染(ran)色。變(bian)性電(dian)泳（左(zuo)圖）：RealPAGE 4-18%預制膠，用(yong)RIPA提取總(zong)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)（RIPA-TP）做(zuo)對(dui)照樣品，使(shi)(shi)用(yong) 含BME上樣緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)調(diao)整上樣濃度為(wei)0.5μg/μl，200V 60min，FastBlue蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)染(ran)色液(ye)(ye)染(ran)色。
2.2 WB檢測：
1 樣品：柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒（RTD8106）提取K562總蛋白（活性提取）；
柱式動物總蛋白提取試劑盒（RTD8302）提取K562總蛋白（變性提取）
2 電泳：RealPAGE Tris-Gly預制膠4-15%,。非變性電泳：1×TG；變性電泳：1×TGS
3 轉膜：0.22μm NC膜；伯樂Turbo半干轉，濾布，一槽兩膠，RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液（RT5030），
恒流2.5A 15min
4 封閉：Western快速封閉液（WR5020）快封10分鐘
5 一抗：β-Tubulin 1:5000(RGT2130)RT 60min；二抗-羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(HGM1060) RT 60min
6 RealECL發光液(EC2520) 曝光1S
右圖：為同樣樣品變性電泳，同時轉膜，背靠背孵育.
結論：
1 β-Tubulin可以作為Tris-甘氨酸非變性系統的對照，結果為多種聚體。
2 柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒（RTD8106）可以很好地非變性提取可溶性蛋白
3 RTD6137 440kD可以轉到(dao)膜上，作為分(fen)子量參照(zhao)