海角国精产品三区二区三区,91精品国产综合久久福利,国产精品无码亚一区二区三区,国产成人精品免费视频www,偷拍视频对白不卡高清精品

動物膜蛋白提取試劑盒（細胞樣品）

(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)

● 產品簡介

動物膜蛋白提取試劑盒（細胞樣品）(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)提供了一種簡便的地從培養細胞或貼壁細胞中提取膜蛋白的方法。提取的膜蛋白不僅包括質膜上的膜蛋白，也包括細胞器膜如線粒體膜、內質網膜和高爾基體膜上的膜蛋白。

本產品與許(xu)多用于分(fen)離(li)(li)膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)白的(de)(de)(de)程序(xu)不同，該(gai)試(shi)劑盒不需(xu)要超聲(sheng)，不需(xu)要耗時的(de)(de)(de)超速(su)離(li)(li)心(xin)，不使(shi)用去(qu)垢劑，最(zui)大限度地保(bao)持了(le)膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)白在(zai)細(xi)胞內(nei)的(de)(de)(de)原(yuan)始狀態。提取的(de)(de)(de)基本原(yuan)理是通過提取溶液和離(li)(li)心(xin)柱(zhu)的(de)(de)(de)協調作(zuo)用提取得到高(gao)純度的(de)(de)(de)膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)白。膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)白提取溶液可以溫(wen)和作(zuo)用于細(xi)胞膜(mo)(mo)(mo)，改(gai)變(bian)細(xi)胞的(de)(de)(de)滲透(tou)壓，然后在(zai)高(gao)速(su)離(li)(li)心(xin)下細(xi)胞通過離(li)(li)心(xin)柱(zhu)，這個過程中細(xi)胞膜(mo)(mo)(mo)會破裂；收集(ji)液700 g低速(su)離(li)(li)心(xin)分(fen)離(li)(li)去(qu)除細(xi)胞核，因(yin)此消除了(le)膜(mo)(mo)(mo)組分(fen)中細(xi)胞核組份的(de)(de)(de)污(wu)染；隨后上清使(shi)用常(chang)規臺(tai)式低溫(wen)離(li)(li)心(xin)機（無(wu)需(xu)超速(su)離(li)(li)心(xin)）16000 g高(gao)速(su)離(li)(li)心(xin)，沉淀即為膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)白。

該(gai)產品約60分鐘即可完成培(pei)養(yang)細胞膜蛋(dan)白的提(ti)取。膜蛋(dan)白是在溫和、非變(bian)性(xing)(xing)(xing)條件(jian)下提(ti)取的，結合(he)不同(tong)的溶解(jie)液，溶解(jie)后的膜蛋(dan)白可以(yi)用(yong)于(yu)SDS-PAGE變(bian)性(xing)(xing)(xing)電(dian)(dian)泳檢(jian)測(ce)、Blue Native非變(bian)性(xing)(xing)(xing)電(dian)(dian)泳檢(jian)測(ce)以(yi)及(ji)等(deng)電(dian)(dian)聚焦電(dian)(dian)泳等(deng)。另(ling)外(wai)，膜蛋(dan)白也(ye)可以(yi)用(yong)于(yu)酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)(xing)測(ce)定，免(mian)疫沉淀，ELISA測(ce)定等(deng)。

對于細胞樣品，如果每次使用細胞的數量為2-5×10⁶，本試劑盒可以提取125個樣品；如果每次使用的細胞數量為1×10⁷細(xi)胞，本試劑盒可以(yi)提(ti)取50個樣品。

● 產品組成

● 貯存、效期和運輸：

根據標(biao)簽溫(wen)(wen)度貯(zhu)存；一年有效；試劑盒常(chang)溫(wen)(wen)運輸。

● 用前必讀：

1. 離心機請調整成(cheng)RCF/g模式，按(an)照離心力設置離心機（不要根據轉速(su)rpm模式設置），所有(you)離心步(bu)驟都需要在(zai)4℃低溫離心機中進行。

2. 將膜(mo)蛋白提(ti)取溶液混(hun)勻后放置于冰上。將離心(xin)柱(zhu)套入2 ml連蓋收集管(guan)中，蓋好管(guan)蓋，放置于冰上預冷。

3. 蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)提(ti)(ti)(ti)取推薦添(tian)加蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)酶抑(yi)(yi)制劑(ji)(ji)（自備，試劑(ji)(ji)盒不提(ti)(ti)(ti)供），根(gen)據蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)酶抑(yi)(yi)制劑(ji)(ji)母液(ye)(ye)濃(nong)度提(ti)(ti)(ti)前(qian)添(tian)加在膜(mo)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)提(ti)(ti)(ti)取溶液(ye)(ye)中（如抑(yi)(yi)制劑(ji)(ji)母液(ye)(ye)是 100×，添(tian)加時按(an)照(zhao)1:100添(tian)加，即1ml膜(mo)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)提(ti)(ti)(ti)取溶液(ye)(ye)添(tian)加10μl抑(yi)(yi)制劑(ji)(ji)）。研究蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)磷酸化(hua)，需要添(tian)加磷酸酶抑(yi)(yi)制劑(ji)(ji)（自備，試劑(ji)(ji)盒不提(ti)(ti)(ti)供）。

4. 蛋(dan)(dan)白定(ding)量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋(dan)(dan)白濃度(du)測定(ding)試劑盒（貨號：RTP7102）。

● 使用方法：

一 培養細胞膜蛋白提取：

1.1 準備溶液：

混勻膜蛋(dan)白提取溶液(ye)，立即(ji)放置在(zai)冰上(shang)。取適當量的溶液(ye)，在(zai)使(shi)用前(qian)數(shu)分鐘內加(jia)入蛋(dan)白酶抑制劑(ji)（自備，試劑(ji)盒(he)不提供(gong)），隨后立即(ji)放于冰上(shang)待(dai)用。按照下表(biao)大體估算膜蛋(dan)白提取溶液(ye)使(shi)用體積：

注： (二百萬，2×10⁶)HeLa細胞，其細胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl。

1.2 準備細胞：

1.2.1 對于(yu)貼壁細(xi)(xi)胞(bao)：細(xi)(xi)胞(bao)用(yong)PBS漂洗(xi)一遍，棄PBS；再(zai)加(jia)入適量(liang)PBS，用(yong)細(xi)(xi)胞(bao)刮刀刮下(xia)細(xi)(xi)胞(bao)，或用(yong)0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處(chu)理細(xi)(xi)胞(bao)使細(xi)(xi)胞(bao)不再(zai)貼壁很緊，并用(yong)移(yi)液器吹打下(xia)細(xi)(xi)胞(bao)。400 g（~2000 rpm） 4℃離心5 min收集細(xi)(xi)胞(bao)，盡(jin)最大(da)努力吸盡(jin)上清(qing)，留下(xia)細(xi)(xi)胞(bao)沉淀備用(yong)。盡(jin)量(liang)避免用(yong)胰酶消化細(xi)(xi)胞(bao)，以免胰酶降解(jie)需提取的目的蛋(dan)白(bai)。

1.2.2 對于懸浮細胞(bao)(bao)：400 g（~2000 rpm）4℃離心(xin)5 min收集細胞(bao)(bao)，用PBS洗一遍，離心(xin)收集細胞(bao)(bao)，盡(jin)最(zui)大努力(li)吸盡(jin)上清，留下細胞(bao)(bao)沉淀備用。

1.3 裂解細胞膜：

1.3.1細胞沉淀中加入準備好的膜蛋白提取溶液（含蛋白酶抑制劑），用移液器吹打重懸細胞沉淀，渦旋劇烈震蕩30-60秒，冰浴處理10分鐘，間歇2-3混勻。

注：提取溶液使用推薦經驗值：起始細胞數低于5×10⁶加入 200 μl 提取溶液，起始細胞數量5×10⁶-1×10⁷加入500 μl提取溶液。如果細胞數目低于1×10⁶或高于1×10⁷，建議調整細胞數目在2-5×10⁶范圍內。

1.3.2 將細胞懸液轉移到離心柱中，蓋上管蓋，16,000 g（~13000 rpm） 4℃離心(xin)1分鐘，離心(xin)后收(shou)集管底部會有沉淀形成。

     注：離心柱最大體積為600 μl；確保離心機可以在10秒內達到16000 g。

   1.3.3 棄去離心(xin)柱(zhu)，蓋(gai)好2 ml收集管管蓋(gai)，用1ml移液器(qi)輕(qing)柔吹打重懸(xuan)收集管中的沉淀。

1.4 去除細胞核：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃離(li)心1分鐘，用(yong)200 μl吸頭小心將上清（上清稍(shao)有渾(hun)濁）轉移到(dao)新的1.5 ml離(li)心管(guan)中(zhong)。注意：轉速不要超過700g，否則會降低膜蛋白的得率。

     關鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉淀，甚至可以丟棄部分上清不吸取，以免上清（含膜蛋白）中污染核蛋白。如果使用200 μl提取溶液，建議吸取150 μl上清；使用500 μl提取溶液，建議吸取400 μl上清。此步驟得到的細(xi)胞核純度不(bu)高，混(hun)雜有(you)沒(mei)有(you)完全破(po)碎的完整細(xi)胞，不(bu)建議用(yong)于相關實驗。

1.5 沉淀膜蛋白：

上清溶液(ye)16000 g（~13000 rpm）  4℃離(li)心30分(fen)鐘，用(yong)200 μl吸頭吸棄(qi)上清，沉淀即為提(ti)取的膜(mo)蛋(dan)白(bai)。上清是胞漿蛋(dan)白(bai)，如需要可保存備用(yong)。

關鍵步驟：此步驟必須完全將上清吸取干凈，可以分次吸取上清，最后用10 μl吸頭將殘余上清徹底吸凈，以免膜蛋白中污染胞漿蛋白。

 二 膜蛋白溶解：

膜蛋白沉淀可以根(gen)據下(xia)游實驗需(xu)求用(yong)50 μl相應溶解液溶解。

注：不建議加入(ru)超過50 μl溶(rong)解液，會導致蛋白濃度偏低。

2.1 膜蛋白變性樣品處理：

2.1.1 建議使用50 μl變性蛋白(bai)溶解(jie)液（貨號：PS1020）溶解(jie)膜蛋白(bai)；

2.1.2 BCA方(fang)法測(ce)定蛋白(bai)濃(nong)度；

2.1.3用變性蛋白溶(rong)解(jie)液調整蛋白濃度為1 μg/μl，按需分裝，每管(guan)50 μl，-80℃保(bao)存待用；

2.1.4取一管50 μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨號：PL080，PL113，PL121）處理，建議調整上樣液濃度為0.5 μg/μl；對于多次跨膜蛋白（Multi-pass membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鐘或者70度處理10分鐘，不要95℃加熱5分(fen)(fen)鐘，因為(wei)(wei)在95℃高溫情況下(xia)，多次(ci)跨膜(mo)蛋白(bai)極易聚(ju)集(ji)形(xing)成多聚(ju)體，樣品會聚(ju)集(ji)，WB檢測會表現為(wei)(wei)比實際蛋白(bai)大小更大的分(fen)(fen)子量；

2.1.5 使(shi)用SDS-PAGE凝膠（貨號：RTD6132，RTD6116）電泳，每個泳道上(shang)樣10-40 μl（5-20 μg）。

2.2 膜蛋白BN非變性樣品處理：

2.2.1 建議使用50 μl膜蛋(dan)白重(zhong)懸液（BN電泳(yong)用）（貨號(hao)：PN1020）重(zhong)懸膜蛋(dan)白沉淀；

2.2.2 BCA方法測定蛋(dan)白濃度（貨號：RTP7102）；

2.2.3 用(yong)膜蛋白(bai)重懸液（BN電泳(yong)用(yong)）調整(zheng)蛋白(bai)濃度為1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用(yong)；

2.2.4 取一(yi)管50 μl樣品，溶化混(hun)勻后4℃ 16000 g 5分鐘，去除上(shang)清，保留沉淀；

2.2.5 沉淀中加入(ru)50 μl膜蛋白增溶(rong)液A（貨(huo)號：DM1080），輕柔重(zhong)懸沉淀，盡量不產生(sheng)氣泡(pao)，冰(bing)浴10分(fen)鐘；

膜蛋白增溶液A配制方法：在增溶(rong)(rong)劑(ji)粉末管中加(jia)入2.5 ml溶(rong)(rong)解(jie)緩沖液(ye)，加(jia)入超(chao)純水精準定容至5 ml，徹底混勻，增溶(rong)(rong)液(ye)中DDM終(zhong)濃度(du)為(wei)1%。

2.2.6 4℃ 16000 g 15分鐘，取(qu)上清(qing)至一干凈1.5 ml離心管中(zhong)即為(wei)增溶后膜蛋白(bai)溶液（小心不要吸(xi)取(qu)沉(chen)淀），此時得到的膜蛋白(bai)濃度(du)為(wei)1 μg/μl，其(qi)中(zhong)去(qu)垢(gou)劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM n-十二烷基-β-D-麥芽(ya)糖苷）終濃度(du)為(wei)1%；

2.2.7 膜(mo)(mo)蛋白溶液中(zhong)加入1/10體積10×膜(mo)(mo)蛋白A型(xing)上樣(yang)緩沖液（配套(tao)膜(mo)(mo)蛋白增溶液A使用）（貨號(hao)：PL130），使用BN凝膠電(dian)泳（貨號(hao)：RTD6139，RTD6140），每個泳道(dao)上樣(yang)5-20 μg。

2.3 膜蛋白等電聚焦樣品處理（2D凝膠第一維電泳）：

建(jian)議膜蛋(dan)白沉(chen)淀(dian)中使(shi)用(yong)溶解(jie)液：7 M尿素(su),2 M硫脲, 2%CHAPS,20mM DTT(自備，試劑盒不提供(gong))。

 三 關于膜蛋白產量和質量的評價：

 3.1 膜蛋白產量：

3.2 膜蛋白質量評價：

膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質量(liang)評價首先看(kan)(kan)提取的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)是(shi)否是(shi)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)，其次要(yao)看(kan)(kan)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)是(shi)否有(you)(you)(you)明(ming)顯的(de)富集，其三要(yao)看(kan)(kan)提出的(de)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)是(shi)否有(you)(you)(you)其他(ta)組分交(jiao)叉污(wu)(wu)(wu)染(ran)(ran)，最后看(kan)(kan)提取的(de)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)中是(shi)否可(ke)(ke)以(yi)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)出目的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)。使(shi)用(yong)(yong)專(zhuan)門的(de)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)內(nei)參(can)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)（下表），可(ke)(ke)以(yi)初步確(que)認提出的(de)是(shi)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)。膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)是(shi)否有(you)(you)(you)效富集需要(yao)用(yong)(yong)總蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)作為對照，與總蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)相比(bi)，膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)中膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)內(nei)參(can)是(shi)否有(you)(you)(you)明(ming)顯富集。膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)中的(de)交(jiao)叉污(wu)(wu)(wu)染(ran)(ran)可(ke)(ke)以(yi)用(yong)(yong)其他(ta)組分內(nei)參(can)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)樣品，如(ru)關注膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)中是(shi)否有(you)(you)(you)細(xi)(xi)胞核(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)污(wu)(wu)(wu)染(ran)(ran)，可(ke)(ke)以(yi)使(shi)用(yong)(yong)核(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)內(nei)參(can)如(ru)Lamin B1檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)，檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)無(wu)條帶(dai)即說(shuo)明(ming)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)與細(xi)(xi)胞核(he)組分無(wu)交(jiao)叉污(wu)(wu)(wu)染(ran)(ran)。用(yong)(yong)目標(biao)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)抗(kang)體檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)膜(mo)(mo)(mo)(mo)(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)，驗證(zheng)是(shi)否可(ke)(ke)以(yi)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)(ce)(ce)到目的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)大小是(shi)否符合(he)預期。

許多研究人員利用 WB對分離的膜蛋白進行純度檢測，經常發現一些常用的胞漿內參能在膜蛋白中檢測到，例如β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和  β-tubulin ^[3]，這是由于這些胞漿內參不僅存在于胞漿也存在于質膜中，因此可以在膜蛋白中檢測到胞漿內參。更多信息，請參閱以下論文：

1. Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology. 64:223-234.  

2. Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes  -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem. 287:42620-42633.

3. Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433.

四 實驗示例：

樣品：K562細胞(bao)，膜蛋白(bai)(bai)提取試劑盒(he)提取膜蛋白(bai)(bai)（M）和胞(bao)漿(jiang)蛋白(bai)(bai)（C），RIPA提取總蛋白(bai)(bai)（TP）

溫度處(chu)理：樣品與SDS-PAGE蛋白(bai)上樣緩(huan)沖液(ye)（貨(huo)號(hao)：PL080）混合，37度處(chu)理30min，70度處(chu)理10min，95度處(chu)理5min

電(dian)泳：4-18% RealPAGE預制膠（貨號：RTD6119-0420），蛋白上樣(yang)量均為5 μg，恒壓200V  55min

轉膜：0.45μm PVDF膜，1×RealBlot轉膜緩沖(chong)液（貨(huo)號：RT5020）濕轉，恒流(liu)400 mA 35min。

封閉：快速(su)封閉液（貨號：WR5020）  RT  10 min

剝離：Western一抗二(er)抗去除液（弱堿(jian)，溫和型） （貨號：WS1200），37度(du)搖(yao)床15 min 

一抗：1 Na-K ATPase  1:5000；2 Calnexin 1:500；3 β-Tubulin 1:5000 ；4 β-Actin 1:10000；5 GAPDH 1:10000； 6 H3 1:10000；7 COXIV 1:5000；常溫(wen)搖床孵育60min

二抗(kang)(kang)：羊抗(kang)(kang)兔IgG-HRP 1:5000（貨號(hao)：HGR1020），羊抗(kang)(kang)鼠(shu)IgG-HRP 1:5000（貨號(hao)：HGM1060），常溫搖床(chuang)孵(fu)育(yu)60min

檢測(ce)(ce)：ECL發光檢測(ce)(ce)（貨(huo)號：EC2520）