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免疫沉淀試劑盒（離(li)心柱法）

 ● 產品簡介：

免疫(yi)沉(chen)(chen)淀（Immunoprecipitation）是一種分(fen)子生物(wu)學技術，用(yong)于通過特定抗(kang)(kang)(kang)體(ti)捕獲目標(biao)抗(kang)(kang)(kang)原（蛋白質(zhi)）。該(gai)產品使用(yong)小(xiao)于10 μg的抗(kang)(kang)(kang)體(ti)即可高效地實現抗(kang)(kang)(kang)原免疫(yi)沉(chen)(chen)淀。首(shou)先將特異性抗(kang)(kang)(kang)體(ti)加(jia)入(ru)樣品中(zhong)形成免疫(yi)復合(he)(he)(he)(he)(he)物(wu)，然后將免疫(yi)復合(he)(he)(he)(he)(he)物(wu)加(jia)到Protein A/G 瓊脂糖樹脂中(zhong)形成Protein A/G-抗(kang)(kang)(kang)體(ti)-抗(kang)(kang)(kang)原復合(he)(he)(he)(he)(he)物(wu)，洗(xi)(xi)滌該(gai)復合(he)(he)(he)(he)(he)物(wu)以(yi)除(chu)去未(wei)結合(he)(he)(he)(he)(he)的物(wu)質(zhi)，再以(yi)變性洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)緩(huan)沖(chong)液或低pH的酸性洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)緩(huan)沖(chong)液將結合(he)(he)(he)(he)(he)的免疫(yi)復合(he)(he)(he)(he)(he)物(wu)從Protein A/G上洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)。

該試(shi)劑盒(he)包含確保(bao)抗原高(gao)產量的優化(hua)緩沖液和高(gao)效(xiao)離(li)心柱和收集管，通過(guo)減少處理和混合時間簡化(hua)實驗步驟，能有效(xiao)避免(mian)普(pu)通離(li)心方法不易吸取(qu)上(shang)清的問題。 離(li)心柱經(jing)過(guo)優化(hua)處理，可以(yi)使用少至20 μl的Protein A/G樹(shu)脂。

特(te)別提(ti)示：試劑盒(he)配套的(de)IP裂解緩沖液含(han)有溫(wen)和的(de)去垢劑Triton X-100，可(ke)以(yi)有效(xiao)提(ti)取胞(bao)漿蛋(dan)(dan)(dan)白和核蛋(dan)(dan)(dan)白。然而(er)對(dui)于部分核蛋(dan)(dan)(dan)白（如與染色體緊密結合的(de)核蛋(dan)(dan)(dan)白）以(yi)及膜蛋(dan)(dan)(dan)白（特(te)別是多次跨膜蛋(dan)(dan)(dan)白）提(ti)取效(xiao)果不(bu)好，不(bu)建議(yi)使用該試劑盒(he)進行免疫沉淀。

以每次(ci)使用20 μl Protein A/G 瓊脂(zhi)糖樹(shu)脂(zhi)計算，試劑盒可以進行20次(ci)IP反應(ying)。

● 產品(pin)組成：

● 產品貯存(cun)、運輸及效期：

按照標簽溫度貯存(cun)；常溫運(yun)輸；有(you)效期一年(nian)。

● 用前必讀：

1. 除非另有說明，所有操作在 4℃下進行。

2. 樹脂的所有離心步驟需在低速（如 1000×g）、1 min條件下操作。離心速度大于 5000× g 可能會導致樹脂聚集，難以重懸。

3. 離(li)心(xin)柱(zhu)離(li)心(xin)過(guo)程中，使(shi)用(yong)2 ml離(li)心(xin)管收集時流穿(chuan)的液體體積(ji)應不超過(guo) 600 μl，使(shi)用(yong)1.5 ml離(li)心(xin)管

收集時則應不超過 300 μl。體積超出可能導致柱內產生回壓及洗滌和洗脫不完全。

4. 使用此試劑盒時抗體將與免疫沉淀的抗原一起被洗脫。因此，在還原型 SDS-PAGE 凝膠或 Western blot時至少產生三個蛋白條帶：抗體重鏈（ ~50 kD） 、輕鏈（~25 kD ）和抗原。如果抗體條帶掩蓋了免疫沉淀的抗原，則可用重鏈或輕鏈專一性IgG-HRP檢測目的蛋白，避免輕重鏈的干擾。

5. 為了優化結果，盡量使用親和純化后的抗體。盡管也可使用血清，但血清樣品中針對目的抗原的特異性抗體含量可能僅占IgG 總量的 1-2%，因此，將導致抗原產量低。

6.  IP 裂解緩沖液已進行過代表性細胞類型的檢測，包括但不限于下列細胞系：  HeLa， Jjurkat，K562，A431，A549，MOPC，NIH  3T3 和 U2OS。通常情況下，10⁶的 HeLa 細胞可以產生約10 mg的細胞團塊，按照~3 μg/μl的配比使用 IP裂(lie)解緩沖液（即 100 μl IP裂(lie)解緩沖液可(ke)以裂(lie)解~300 μg細(xi)胞團(tuan)塊(kuai) ）。   

7. 為了獲得最佳結果，可添加蛋白酶抑制劑或/和磷酸酶抑制劑，以盡量減少細胞裂解液中蛋白質的降解和去磷酸化。

8. IP裂解緩沖液可兼容BCA蛋(dan)白(bai)濃度(du)測定試劑盒（貨號：RTP7102）。

9. 在(zai)免(mian)疫沉(chen)淀時(shi)，建議按照步驟2.2使用(yong)與捕獲(huo)抗體種屬相同(tong)的正常IgG配制相同(tong)稀釋(shi)比(bi)的工(gong)作液作為陰性對照。本試(shi)劑盒(he)中未提供IgG，客戶請自備。

● 操作(zuo)步驟(zou)：

一(yi). 哺乳動(dong)物細胞(bao)裂解 ：

1.1 裂解貼壁細胞 ：

1.1.1 小心去除細胞中的培養基。

1.1.2 用 PBS清洗細胞一次。

1.1.3 將冰上預冷的 IP裂(lie)解緩(huan)沖(chong)液加入細(xi)胞(bao)中（表1）；冰上孵育 5 分鐘并間歇(xie)混勻；用(yong)(yong)細(xi)胞(bao)刮刀刮下(xia)細(xi)胞(bao)或用(yong)(yong)移液器吹打下(xia)細(xi)胞(bao)。

表 1 不同標準的細胞培養皿/板中 IP裂解緩沖液的建議(yi)添加量

1.1.4 將細胞裂解液轉移到微量離心管中，冰浴10-30分鐘，間歇混勻；13000 ×g離心10分鐘以沉淀細胞碎片。

1.1.5 將上清轉移到一個新的微量離心管中用于進行蛋白濃度測定和后續分析。

1.2 裂解(jie)懸(xuan)浮細胞：

1.2.1將細胞懸浮液在 450 ×g下離心 5分鐘以沉淀細胞；棄掉上清。

1.2.2將細胞團塊用 PBS重懸洗滌一次。450× g離心 5分鐘再次沉淀細胞。

1.2.3將冰上預冷的 IP裂解緩沖液加到細胞團塊中。每 50 μl濕重細胞沉淀體積加入 500 μl IP裂解緩沖液。注：(五百萬，5×10⁶) Jurkat細胞，其細胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為50 μl。

1.2.4  將細胞裂解液在冰上孵育10-30分鐘并間歇混勻。13000 ×g離心10 分鐘去除細胞碎片。

1.2.5 將上清轉移到一個新的微量離心管中用于進行蛋白濃度測定和后續分析。

二. 制備免疫復合物：

 注：樣品用量和孵育時間取決于每個特定的抗體-抗原體系，并且可能需要優化實驗方案以使產量最大化。以下方案是針對 2-10 μg 親和純化的抗體（Protein A/G 瓊脂糖樹脂使用20 μl），且可以根據需要按比例放大。

2.1 將 2-10 μg親和純化的抗體與步驟1.2.5得到的細胞裂解液上清在微量離心管中混合，混合體積控制在300 - 600 μl。每個IP反應總蛋白建議量是 500-1000 μg。

2.2 可選：可以(yi)使(shi)用與(yu)IP捕(bu)獲抗(kang)體(ti)種屬相(xiang)(xiang)同的(de)正常(chang)IgG配制相(xiang)(xiang)同稀釋比的(de)工作液(ye)，作為陰性對照(zhao)。如IP捕(bu)獲抗(kang)體(ti)使(shi)用兔(tu)源抗(kang)體(ti)，陰性對照(zhao)則使(shi)用兔(tu)IgG。

2.3 在 4℃旋轉孵育 1小時至過夜，以形成免疫復合物。

三. 捕獲免疫復合物：

3.1 輕旋 Protein A/G 瓊脂糖樹脂，以獲得均一的懸浮液。使用大口徑或截短槍頭取20 μl樹脂漿液加入離心柱中。將離心柱放于收集管中，1000×g 離心1分鐘，棄掉流穿液體。

3.2 用200 μl預冷的洗滌緩沖液洗滌樹脂兩次；每次洗滌后棄掉流穿液體。

3.3 將步驟2.3的免疫復合物樣品加入含有Protein A/G 瓊脂糖樹脂的離心柱中，蓋上管蓋溫和地上下翻轉常溫孵育 1 小時。

3.4 將(jiang)離心(xin)柱置于一干凈的2 ml離心(xin)管(guan)中（自備）。1000×g 離心(xin)1分鐘并保留(liu)流穿液(ye)體。

注：在確定 IP反應成功之前不要丟棄該液體。

3.5 將離心柱置于一個(ge)新的1.5 ml離心管中(zhong)(自(zi)備)，加入200 μl 洗滌緩(huan)沖液，1000×g 離心 1 分鐘，棄流穿(chuan)液。

3.6 重復步驟3.5二次。

四. 洗脫免疫復合物：

注：有兩種方案可以洗脫免疫復合物。變性緩沖液洗脫適用于 Western blot 分析；酸性洗脫液適用于酶法或功能測定。

4.1 變性洗脫液洗脫：

4.1.1 將含有(you)樹(shu)脂的(de)離(li)心柱置于一個新的(de)1.5 ml離(li)心管中（自(zi)備(bei)），加(jia)入50 μl 變性(xing)洗(xi)脫液，在(zai)95℃下孵育10 分鐘(zhong)。

4.1.2 1000×g 離心1 min，收集洗脫液。

注：加熱含有變性洗脫液的樹脂后，該樹脂將不能被重復使用且必須丟棄。

4.2 酸性洗(xi)脫(tuo)液洗(xi)脫(tuo)：

4.2.1 將離(li)心柱置于一個(ge)新(xin)的(de)1.5 ml離(li)心管中（自備(bei)），加入(ru) 50 μl酸性洗脫液。在常溫下孵育(yu) 10分鐘。1000×g 離(li)心1min，收集洗脫液。

4.2.2 為了中和低pH 值的酸性洗脫緩沖液（例如為了進行下游的酶法或功能測定），洗脫后立即向洗脫液中加入1/10體積中和緩沖液，如50 μl洗脫液加入5 μl中和緩沖液，混勻。

● 實驗(yan)示(shi)例：

1 制備免疫復合物：

GAPDH-IP：5 μl GAPDH兔單抗加(jia)400μl（640 μg）K562總蛋白（1.6 μg/μl），4度 混(hun)勻1h

IgG-IP：1 μl兔IgG加400 μl（640 μg）K562總蛋白（1.6 μg/μl），4度 混勻1h

2 捕獲(huo)免(mian)疫復合(he)物：

取20 μl Protein A/G加入離心柱中，1000g min；100 μl IP裂解液洗滌兩次(ci)；

將免疫(yi)復合(he)物(wu)上柱，RT 混勻1h，形成Protein A/G-Ab-An復合(he)物(wu)；200 μl 1×TBS洗(xi)滌(di)柱3次

3 洗脫(tuo)免(mian)疫(yi)復合(he)物-變性洗脫(tuo)：

用干凈的(de)1.5ml 離(li)心(xin)管(guan)做(zuo)收集管(guan)，柱子中加入50 μl 變(bian)性洗脫液，95度 10 min；1000g 1min，收集管(guan)內為待測樣品；IgG-IP 上樣10 μl，GAPDH-IP 上樣5，10，15 μl。

 Input為IP裂解液(ye)提取(qu)K562總蛋白，5×BME配制成1μg/μl上(shang)(shang)樣液(ye)，上(shang)(shang)樣10 μl（10 μg）

4 電泳：4-20% 梯(ti)度膠(jiao) 200V 50min

5 轉(zhuan)膜：Turbo快速(su)半(ban)干轉(zhuan)，濾布，0.22 NC膜，恒(heng)流1.3A 10min。

6 快(kuai)封(feng)：快(kuai)速(su)封(feng)閉液（WR5020 ）RT封(feng)閉10min

7 檢測：兔GAPDH單抗1：5000 RT 1h，羊抗兔IgG-HRP 1：5000 RT 1h，ECL 1秒