EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
PAGE
Electrophoresis Kit for EMSA
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貨號
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名稱
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規(gui)格(ge)
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RTE4104
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EMSA PAGE凝(ning)膠(jiao)配制試劑盒
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30-60次
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● 產品組成：
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貨號
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名稱
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規(gui)格
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貯(zhu)存
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RTE4104-01
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40%PAA(37.5:1)
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50 ml
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4℃，避(bi)光
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RTE4104-02
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5×TBE
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50 ml
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RT
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RTE4104-03
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80%甘油
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20 ml
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RT
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AP020P
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APS（干(gan)粉(fen)）
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5 ml
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RT（配制后(hou)-20℃貯存）
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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● 產品簡介：
EMSA PAGE凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)配制(zhi)(zhi)試劑(ji)盒(PAGE Gel Preparation Kit for PAGE)提供了配制(zhi)(zhi)EMSA PAGE凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)所需(xu)的(de)(de)各種試劑(ji)，用(yong)戶只需(xu)自備制(zhi)(zhi)膠(jiao)(jiao)器(qi)具和蒸餾水，即可配制(zhi)(zhi)不同濃度(du)的(de)(de)EMSA PAGE凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)。凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)遷移實驗(也稱凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)阻滯(zhi)實驗或(huo)(huo)(huo)電泳遷移率(lv)實驗)
(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，也稱Gel Shift，是一種用(yong)于(yu)研究蛋(dan)白(bai)與(yu)核酸(suan)相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)高靈敏實驗技(ji)術(shu)。主要用(yong)于(yu)轉錄因(yin)子與(yu)啟動子相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)驗證(zheng)性實驗，也可應(ying)用(yong)于(yu)蛋(dan)白(bai)與(yu)DNA、蛋(dan)白(bai)與(yu)RNA相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)研究。EMSA技(ji)術(shu)基于(yu)進行非變性聚丙(bing)烯酰胺或(huo)(huo)(huo)瓊脂糖凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)電泳時(shi)，蛋(dan)白(bai)質(zhi)與(yu)DNA或(huo)(huo)(huo)RNA復合物的(de)(de)遷移速度(du)比游離線性DNA或(huo)(huo)(huo)RNA片段慢，從而導致(zhi)DNA或(huo)(huo)(huo)RNA遷移位置在與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)結合時(shi)滯(zhi)后。
本試劑盒大(da)(da)約可以(yi)配制(zhi)30-50塊(kuai)常規(gui)大(da)(da)小（8×10 cm）PAGE凝膠(jiao)(jiao)(jiao)，具體數量根據凝膠(jiao)(jiao)(jiao)厚度決定：0.75mm厚度凝膠(jiao)(jiao)(jiao)可以(yi)配制(zhi)60塊(kuai)膠(jiao)(jiao)(jiao)，1 mm厚度凝膠(jiao)(jiao)(jiao)可以(yi)配制(zhi)45塊(kuai)膠(jiao)(jiao)(jiao)，1.5 mm厚度凝膠(jiao)(jiao)(jiao)可以(yi)配制(zhi)30塊(kuai)膠(jiao)(jiao)(jiao)。
● 貯存和效期：
本產(chan)品常溫運輸；按照標簽溫度貯存；有效期一年。
● 使用說明：
10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉(fen)溶(rong)于5 ml滅菌水中(zhong)，徹底(di)溶(rong)解(jie)后分裝(zhuang)，1 ml/支，-20℃備存(cun)，每次(ci)取一管使用。10% APS應盡量(liang)減少常溫存(cun)放(fang)時間(jian)，以(yi)防(fang)失效(xiao)，若發現凝膠聚合時間(jian)延長(chang)，應考慮更換使用-20度保存(cun)的10% APS。
一、制備凝膠步驟：
1.1 參(can)照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2按照表(biao)格將不(bu)同體(ti)(ti)積(ji)的成分(fen)在小燒杯(bei)中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪(jiao)拌使其混勻，避免(mian)產生氣泡。配制一(yi)塊常用(yong)EMSA PAGE膠(jiao)(8×10 cm)所需凝膠(jiao)溶液體(ti)(ti)積(ji)：0.75 mm厚(hou)(hou)(hou)度凝膠(jiao)約(yue)5 ml；1 mm厚(hou)(hou)(hou)度凝膠(jiao)約(yue)7 ml；1.5 mm厚(hou)(hou)(hou)度凝膠(jiao)約(yue)10 ml。均含約(yue)0.5 ml的余(yu)量。
EMSA PAGE凝膠配方表一 (0.75 m厚度凝膠)：
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總體積5 ml，適(shi)用于(yu)厚度0.75 mm小板膠
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各組份(fen)體積（ml）
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膠濃度
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滅(mie)菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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3.8
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0.5
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0.156
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0.5
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0.05
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0.005
|
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5%
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3.66
|
0.625
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0.156
|
0.5
|
0.05
|
0.005
|
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6%
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3.54
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0.75
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0.156
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0.5
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0.05
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0.005
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EMSA PAGE凝膠配方表二 (1.0 mm厚度凝膠)：
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總體積7 ml，適用(yong)于厚(hou)度1 mm小板膠
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各組份體積（ml）
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膠濃度(du)
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滅菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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5.3
|
0.7
|
0.22
|
0.7
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0.07
|
0.007
|
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5%
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5.2
|
0.875
|
0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
|
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6%
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5.0
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1.05
|
0.22
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0.7
|
0.07
|
0.007
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EMSA PAGE凝膠配方表三 (1.5 mm厚度凝膠)：
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總體(ti)積10 ml，適用于厚度1.5 mm小(xiao)板膠
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各(ge)組份體(ti)積(ji)（ml）
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膠濃度(du)
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滅(mie)菌水
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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7.6
|
1
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0.313
|
1
|
0.1
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0.01
|
|
5%
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7.4
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1.25
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
|
6%
|
7.1
|
1.5
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
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1.3在(zai)玻璃(li)板(ban)(ban)中灌(guan)入凝膠溶(rong)液至玻璃(li)板(ban)(ban)頂端，插入梳(shu)子，避免產生氣(qi)泡。
1.4靜置20-60分(fen)鐘(zhong)，等待凝膠完全聚(ju)合。
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環境溫(wen)度
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凝固時間(jian)
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低(di)于18度(du)
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＞60分鐘
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18度
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~40分鐘(zhong)
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25度
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~30分鐘
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高于25度(du)
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~20分鐘
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注：凝膠的(de)聚合(he)時間與(yu)環境溫(wen)(wen)度有關。夏天溫(wen)(wen)度較高時，聚合(he)較快；冬天氣溫(wen)(wen)低(di)時，聚合(he)時間會(hui)延長(chang)。可以根(gen)據(ju)環境溫(wen)(wen)度的(de)不同(tong)調(diao)節APS的(de)加入量。
二、電泳：
2.1預電泳(yong)：拔出梳子，用0.5×TBE緩(huan)沖液(ye)徹(che)底沖洗加(jia)樣(yang)孔2-3次。電泳(yong)槽內外加(jia)入適量0.5×TBE緩(huan)沖液(ye)，穩壓100 V預電泳(yong)10分(fen)鐘。
注：試劑盒配套的(de)5×TBE緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液僅夠(gou)配制凝膠用(yong)，0.5×TBE電泳緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液請自己制備，配方如下：
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終濃度
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順序(xu)
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原料(liao)
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1升(sheng)
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5 升
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44.5 mM
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1
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Tris堿 [MW121.14]
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5.4 克
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27克
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1 mM
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2
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EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
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0.372 克
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1.86克
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44.5 MM
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3
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硼酸 [MW61.83]
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2.75 克
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13.75克(ke)
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4
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超純(chun)水最后定容(rong)至(zhi)
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1 升
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5 升(sheng)
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最后pH在8.2-8.3之間(jian)，可(ke)以不用(yong)調節pH，記錄每(mei)批(pi)pH
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2.2 把混合了無色(se)上(shang)樣(yang)(yang)(yang)緩沖液(ye)的(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)品加入到上(shang)樣(yang)(yang)(yang)孔內(nei)。在多余的(de)(de)某個上(shang)樣(yang)(yang)(yang)孔內(nei)加入10 μl稀(xi)釋好的(de)(de)1X的(de)(de)EMSA 上(shang)樣(yang)(yang)(yang)緩沖液(ye)(藍色(se))，用于觀察電(dian)泳進行的(de)(de)情況。
2.3 穩壓100 V電泳，可以冰浴或4度條件下電泳，確保膠的溫度不超過30℃。電泳至上樣緩沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。