單鏈DNA Marker（20-75 nt）非預混型
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貨(huo)號(hao)
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名稱(cheng)
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規格
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RTM507
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單(dan)鏈DNA Marker（20-75 nt）
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25次(ci)
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● 產品編號及規格：
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貨號
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名稱
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規格
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貯存
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RTM507-01
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單鏈(lian)DNA Marker（20-75 nt）
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62.5 μl
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-20℃
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DL080-01
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2×TBE尿(niao)素上樣(yang)緩(huan)沖液
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1 ml
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4℃
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DL112-01
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2×非(fei)變性PAGE DNA上(shang)樣緩沖(chong)液
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1 ml
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4℃
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● 產品簡介：
單鏈DNA Marker由(you)不(bu)同長度(du)的單鏈DNA分子混合而成，7條帶(dai)的大小(xiao)為20，25，30，35，40，
50，75
nt。該產品不(bu)含有上樣緩沖液，可(ke)以(yi)根據實驗需(xu)求使用不(bu)同的上樣緩沖液，用于尿素(su)變性電泳(yong)或非變性電泳(yong)。電泳(yong)后的PAGE膠可(ke)以(yi)使用單鏈DNA
PAGE電泳(yong)染(ran)(ran)(ran)色(se)試(shi)(shi)劑(ji)盒（Cat：RTS5103），核(he)酸(suan)PAGE電泳(yong)染(ran)(ran)(ran)色(se)試(shi)(shi)劑(ji)盒（Cat：RTS5102），核(he)酸(suan)快速高靈敏(min)度(du)染(ran)(ran)(ran)色(se)試(shi)(shi)劑(ji)盒（Cat：RTS5101）或核(he)酸(suan)染(ran)(ran)(ran)料如RealSafe
Red（貨號：GR002）或RealSafe
All（貨號：GR004）進行染(ran)(ran)(ran)色(se)，均(jun)可(ke)以(yi)得(de)到清晰(xi)的條帶(dai)分離效(xiao)果。
產品附帶2×TBE尿素上樣(yang)緩沖(chong)液(ye)和(he)2×非(fei)變性PAGE DNA上樣(yang)緩沖(chong)液(ye)，方便待(dai)檢樣(yang)品的上樣(yang)。
配制好的即(ji)用(yong)(yong)型單(dan)鏈DNA Marker以每次上樣5 μl計(ji)算，該產品可以使用(yong)(yong)大(da)約(yue)25次。
● 保存條件和運輸：
按照標(biao)簽溫度貯存；有(you)效期(qi)2年(nian)；濕冰運輸。
● 使用方法：
一. 即用型單鏈DNA Marker（20-75
nt）配制方法：
1.1 進行尿素變(bian)性電(dian)泳：
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即用型單鏈DNA
Marker（20-75 nt）
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配(pei)制體(ti)積 20 μl
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DNA
Marker（20-75 nt）
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10 μl
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2×TBE尿素上樣緩沖液(ye)
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10 μl
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混勻，70℃處(chu)理5分鐘
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1.2 進行非變(bian)性電(dian)泳(yong)：
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即(ji)用型單(dan)鏈(lian)DNA
Marker（20-75 nt）
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配制體積 20 μl
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DNA
Marker（20-75 nt）
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10 μl
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2×非(fei)變性PAGE DNA上樣緩沖液
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10 μl
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混勻，不用加熱處理
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二. 凝膠制備：
注(zhu)：以(yi)下使用(yong)方法均以(yi)8×10cm凝(ning)膠 厚(hou)1.0mm示(shi)例，其他規格凝(ning)膠請適當(dang)調(diao)整(zheng)。
2.1 TBE-尿素凝膠制備：
2.1.1 可(ke)以(yi)選擇DNA尿(niao)素PAGE電(dian)泳(yong)試劑(ji)盒（Cat：RTE4102））或按照以(yi)下(xia)程序制膠：
表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
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單鏈DNA長度(du)
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最佳凝(ning)膠(jiao)濃(nong)度(du)
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尿素（克）
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40%PAA
（29:1）
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10×TBE
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補水到總體積
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10%APS
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TEMED
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200-1000 nt
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5%
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2.1克
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0.625 ml
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0.5 ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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50-400 nt
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8%
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2.1克(ke)
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1 ml
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0.5
ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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30-300 nt
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10%
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2.1克
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1.25 ml
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0.5
ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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10-150 nt
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15%
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2.1克
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1.875 ml
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0.5
ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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5-120 nt
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20%
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2.1克
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2.5 ml
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0.5
ml
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5 ml
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50 μl
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5 μl
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2.1.2在(zai)凝膠模(mo)具(ju)中灌(guan)入適量分(fen)(fen)離(li)膠溶液(ye)(ye)（對(dui)于mini-gel，凝膠液(ye)(ye)加至約距(ju)前玻璃板頂(ding)端1.5 cm或(huo)距(ju)梳齒約0.5 cm即(ji)可(ke)），然后在(zai)分(fen)(fen)離(li)膠溶液(ye)(ye)上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
2.1.3靜(jing)置10-20分(fen)鐘，待分(fen)離膠和水層之間(jian)出現一個(ge)清晰的界面后(hou)，說(shuo)明凝(ning)膠已聚合。
注(zhu)：凝膠的(de)聚合(he)(he)時間(jian)與環境溫度(du)有關。夏(xia)天溫度(du)較高時，聚合(he)(he)較快；冬天氣溫低時，聚合(he)(he)時間(jian)會延長。可以根據環境溫度(du)的(de)不同調(diao)節APS的(de)加入量。
2.1.4去除覆蓋在分(fen)離膠上(shang)的水層(ceng)；按照表二將(jiang)不同體積成分(fen)在一個小燒杯中混合；最后加入10%過硫(liu)酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chan)生氣(qi)泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，適用于1.0mm厚度膠)
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各組份(fen)體積（ml）
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凝膠濃(nong)度(du)
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尿素
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40%PAA（29:1）
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10×TBE
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滅菌(jun)水
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10%APS
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TEMED
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4%
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0.84克
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0.2 ml
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0.2 ml
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補水至體(ti)積2 ml
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20 μl
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2 μl
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2.1.5將濃縮膠(jiao)溶(rong)液加至分離膠(jiao)的(de)上(shang)面，直(zhi)至凝(ning)膠(jiao)溶(rong)液到達(da)前玻璃板的(de)頂端；將梳子插入(ru)凝(ning)膠(jiao)內，避免產(chan)生氣泡。
2.1.6靜置(zhi)30-60分鐘，等(deng)待(dai)濃縮膠聚合。
注：凝(ning)膠的(de)聚合(he)(he)時(shi)(shi)間與環(huan)境溫(wen)(wen)度有關。夏天溫(wen)(wen)度較高時(shi)(shi)，聚合(he)(he)較快；冬天氣溫(wen)(wen)低時(shi)(shi)，聚合(he)(he)時(shi)(shi)間會延長(chang)。可以(yi)根據環(huan)境溫(wen)(wen)度的(de)不同調節APS的(de)加入量。
2.2非變性凝膠制備：
2.2.1可以(yi)選(xuan)擇DNA非變性PAGE電(dian)泳試(shi)劑盒（貨號(hao)：RTE4101）或按照以(yi)下程序制膠。
2.2.2按照表三將不同體積(ji)的成分在小燒杯或試管中混(hun)合；最后加入(ru)10%APS和(he)TEMED，輕輕攪拌使其混(hun)勻，避免產生氣泡。
2.2.3在(zai)凝膠(jiao)(jiao)模具中灌入適(shi)量分(fen)離(li)膠(jiao)(jiao)溶液（對于mini-gel，凝膠(jiao)(jiao)液加至約距前玻(bo)璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即(ji)可），然(ran)后在(zai)分(fen)離(li)膠(jiao)(jiao)溶液上輕輕覆蓋(gai)一層1-5
cm的水層，使(shi)凝膠(jiao)(jiao)表面保持(chi)平整(zheng)。
2.2.4靜置10-20分鐘(zhong)，待(dai)分離(li)膠和水層之間(jian)出現一(yi)個清晰的界面后，說明凝膠已(yi)聚合
表三 TBE-非變性PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
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各(ge)組份體(ti)積（ml）
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最佳DNA分離(li)范(fan)圍
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凝膠濃度
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滅菌(jun)水(shui)
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
|
1.0
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1.0
|
0.05
|
0.005
|
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60-460 bp
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8%
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2.66
|
1.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
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50-300 bp
|
10%
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2.33
|
1.67
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
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40-200 bp
|
12%
|
2
|
2.0
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
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25-150 bp
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15%
|
1.5
|
2.5
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
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5-100 bp
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20%
|
0.66
|
3.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
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注(zhu)：凝膠的(de)聚(ju)合時(shi)(shi)(shi)間與環境溫度(du)(du)有關。夏天溫度(du)(du)較高時(shi)(shi)(shi)，聚(ju)合較快；冬(dong)天氣溫低時(shi)(shi)(shi)，聚(ju)合時(shi)(shi)(shi)間會延長。可以根(gen)據環境溫度(du)(du)的(de)不同調節APS的(de)加入量(liang)。
2.2.5去除覆(fu)蓋在分(fen)離(li)膠上的水(shui)層；按照(zhao)表(biao)四將不同體積成分(fen)在一個小燒杯或試管(guan)中(zhong)混(hun)合；最(zui)后加(jia)入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混(hun)勻，避免(mian)產生氣泡。
表四 TBE-非變性PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1.0mm厚度膠)
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各組份體積（ml）
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凝膠(jiao)濃度
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滅(mie)菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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|
4%
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1.0
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0.2
|
0.3
|
0.02
|
0.002
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2.2.6將(jiang)濃(nong)縮膠溶液加至(zhi)分離膠的上面，直(zhi)至(zhi)凝(ning)膠溶液到(dao)達前玻璃板的頂端；將(jiang)梳(shu)子插入凝(ning)膠內(nei)，避免產生氣泡。
2.2.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚(ju)合。
注(zhu)：凝膠的(de)聚(ju)合(he)時(shi)間與環境溫(wen)(wen)(wen)度(du)有關。夏(xia)天溫(wen)(wen)(wen)度(du)較(jiao)(jiao)高時(shi)，聚(ju)合(he)較(jiao)(jiao)快；冬天氣溫(wen)(wen)(wen)低時(shi)，聚(ju)合(he)時(shi)間會延長。可(ke)以根據環境溫(wen)(wen)(wen)度(du)的(de)不同調節APS的(de)加入量。
三. 樣品制備：
3.1
根據實驗目的，配制即用型單(dan)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA
Marker樣(yang)品（步驟一）。單(dan)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA樣(yang)品使用尿素(su)變性電泳(yong)，雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)DNA樣(yang)品使用非變性電泳(yong)，單(dan)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)/雙(shuang)鏈(lian)(lian)(lian)(lian)混合樣(yang)品使用非變性電泳(yong)。
四. 電泳：
4.1. 預電泳（可選）：電泳槽內外加入適量1×TBE緩沖液穩壓200V預電泳30分鐘。電泳結束后，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。
4.2.上樣(yang)：根據梳齒確定Marker上樣(yang)量， 一般是10齒1mm厚(hou)梳子(zi)上樣(yang)5
μl，15齒1mm厚(hou)梳子(zi)上樣(yang)3
μl。
4.3. 連(lian)接電源線，打(da)開電源開關，按照(zhao)以(yi)下條件電泳(yong)。
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恒電壓
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起始(shi)電流
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結束電流(liu)
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電泳時間
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適用條件
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推薦(jian)電壓
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200 V
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15-20 mA/板膠
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10-15 mA/板膠
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60+ min
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最佳電壓，最優的(de)分辨率
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4.4. 等待上(shang)樣緩沖(chong)液的(de)溴(xiu)酚藍指示前(qian)沿到凝(ning)(ning)膠底部時終止電(dian)泳，取出(chu)凝(ning)(ning)膠進行(xing)后續實驗。
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膠(jiao)濃度
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溴酚藍
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二甲苯菁
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5%
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~35 nt
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~130 nt
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8%
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~19 nt
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~75 nt
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10%
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~15 nt
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~55 nt
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15%
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~10 nt
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~52 nt
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20%
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~8 nt
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~35 nt
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五．染色：
用(yong)單鏈(lian)DNA PAGE電(dian)泳染(ran)色(se)(se)(se)試劑(ji)盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電(dian)泳染(ran)色(se)(se)(se)試劑(ji)盒（Cat：RTS5102）或(huo)核酸快速(su)高(gao)靈(ling)敏度(du)染(ran)色(se)(se)(se)試劑(ji)盒（Cat：RTS5101）染(ran)色(se)(se)(se)均可(ke)以得(de)到(dao)清(qing)晰的條帶分離效(xiao)果(guo)(guo)。注(zhu)：如(ru)果(guo)(guo)使用(yong)核酸染(ran)料染(ran)色(se)(se)(se)，RealSafe Red（貨(huo)號(hao)：GR002）或(huo)RealSafe All（貨(huo)號(hao)：GR004）核酸染(ran)料結合(he)單鏈(lian)核酸效(xiao)果(guo)(guo)最佳，強(qiang)烈(lie)建(jian)議使用(yong)以便獲得(de)最佳效(xiao)果(guo)(guo)的膠(jiao)圖。其余染(ran)料如(ru)GelRed，Goldview，EB等(deng)染(ran)色(se)(se)(se)效(xiao)果(guo)(guo)不好。
● 電泳示例：
1. 使(shi)用RealSafe Red核酸染料（貨(huo)號：GR002）染色：
15%尿(niao)素變性膠(jiao)分離(li)單鏈(lian)DNA
lane 1-9 為10，15，20，25，30，35，40，50，75 nt ssDNA 上樣量為0.5 μg
lane 10：RTM501，單鏈DNA Marker（20-75 nt）預混型，上樣量5 μl
lane 11：RTM507，單鏈DNA Marker（20-75 nt）非預混型，配制后上樣量5 μl
lane 12：RTM508，單鏈DNA Marker（10-75 nt）預混型，上樣量5 μl
電泳條件：1×TBE，恒壓200 V 50 min
染色：RealSafe Red后染20min，紫外激發