T4連接酶
T4 DNA ligase
貨號：RTT2101
● 產品組成：
|
名稱
|
規格
|
|
T4 DNA ligase (5U/μl)
|
100 U (20μl)
|
|
10×T4 DNA Ligation Buffer
|
0.2 ml
|
|
50%PEG Solution
|
0.15 ml
|
● 保存(cun)：-20℃
● 產品簡介(jie)：
T4 DNA
Ligase 是從表(biao)達T4
DNA Ligase 基因(yin)的(de)(de)大腸桿菌經誘導(dao)表(biao)達后分離純化(hua)而來的(de)(de)，催化(hua)相鄰DNA鏈(lian)的(de)(de)5’磷(lin)酸(suan)(suan)基團和(he)3’羥基基團以(yi)磷(lin)酸(suan)(suan)二酯鍵(jian)結合反應(ying)。該酶可催化(hua)平末端(duan)(duan)或粘性末端(duan)(duan)DNA之間(jian)的(de)(de)連接，還(huan)可修復雙鏈(lian)DNA、RNA、DNA/RNA雜交雙鏈(lian)中的(de)(de)單鏈(lian)切(qie)口。本品(pin)可應(ying)用于(yu)DNA插入片段和(he)載體DNA的(de)(de)粘性末端(duan)(duan)和(he)平末端(duan)(duan)的(de)(de)連接，以(yi)及線性DNA的(de)(de)自身環化(hua)。
活性定義：此酶的活力單位為(wei)Weiss Unit。1個(ge)(ge)Weiss
Unit相當于約200個(ge)(ge)粘性末端連接單位（cohesive-end
ligation unit, CEU）。1個(ge)(ge)CEU單位定義為(wei)在(zai)(zai)20 μl的連接反應體系中，在(zai)(zai)16℃30分鐘內(nei)，能使50%的經HindIII消化的λDNA片段連接所(suo)需的酶量(liang)。
● 注意事(shi)項
1．T4
DNA Ligase的最終用量(liang)(liang)不要(yao)超過推薦的用量(liang)(liang)，否則影響連接(jie)效率。
2．PEG可以極大提高(gao)(gao)平末端的連(lian)接(jie)效率(lv)，我們推薦加入終濃度為5%
PEG Solution以提高(gao)(gao)平末端的連(lian)接(jie)效率(lv)。
3．為了(le)提高轉化(hua)效率，轉化(hua)時建(jian)議(yi)所加入連接產物的量不要超(chao)過感受態(tai)細胞體積(ji)的10%。
4．由于T4
DNA Ligase中含有甘油，比(bi)較粘稠容易掛壁，建議使用(yong)前短暫離心將液體收集(ji)到管底，取(qu)樣時槍頭盡(jin)量不要深入(ru)液面太深以免粘在槍頭上(shang)造成(cheng)損(sun)失。
● 使用方法：
一
DNA片段和載(zai)體DNA的連(lian)接
1）粘(zhan)性末(mo)端的連接
1．反應體系:
|
|
10μl體(ti)(ti)系(xi)
|
終濃度
|
|
線性載(zai)體(ti)DNA
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
插入DNA片(pian)段(duan)
|
y μl
|
插入片段：載體(ti)=1:1-5:1*
|
|
10×ligation
buffer
|
1 μl
|
1×
|
|
T4 DNA
ligase(5U/μl)
|
0.1 μl
|
0.5 U
|
|
ddH2O
|
up to 10 μl
|
|
*：載(zai)體(ti)與插(cha)入(ru)片(pian)段的摩爾(er)數比需要優化(hua)：一般(ban)vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結果。用(yong)以下公式計算片(pian)段摩爾(er)數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片(pian)段bp數)×1000。例如：插(cha)入(ru)片(pian)段2000bp，線性載(zai)體(ti)為(wei)(wei)3000bp，如果載(zai)體(ti)使用(yong)量為(wei)(wei)50ng（0.025pmol），10μl連接體(ti)系中vector:insert的摩爾(er)比是(shi)1:3，則需要2000bp pmol數為(wei)(wei)0.075pmol，插(cha)入(ru)片(pian)段2000bp的使用(yong)量為(wei)(wei)100ng。
2．徹(che)底(di)輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁(bi)上的(de)溶液收集到管底(di)。
3．反應條(tiao)件：16℃孵育30分(fen)鐘(zhong)。
4．可(ke)取5
μl連(lian)接產物熱(re)擊(ji)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)50
μl感受態細胞(bao)或取1-2
μl連(lian)接產物電擊(ji)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)50
μl感受態細胞(bao)。
注(zhu)：1）若要提高電轉實驗效(xiao)率，推(tui)薦65℃孵(fu)育10分鐘或70℃孵育5分鐘以(yi)滅活T4 DNA Ligase后(hou)(hou)，用DNA產(chan)物純化(hua)試劑盒對連(lian)接后(hou)(hou)的(de)DNA片段進行(xing)純化(hua)后(hou)(hou)進行(xing)電(dian)擊轉化(hua)。
2）若要提高(gao)轉化子數(shu)目(mu)，可將連(lian)接時間延長(chang)至1小時。
3）在10
μl連接(jie)體系中若T4連接(jie)酶的(de)終濃度大(da)于(yu)1
U，必須(xu)對連接(jie)后的(de)DNA片段進行純化后方可進行電轉。
2）平末端的連接
1．反應體系:
|
|
10μl體系
|
終濃度
|
|
線性平(ping)末端(duan)載體DNA*
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
插(cha)入(ru)DNA片段
|
y μl
|
插(cha)入片段：載體=1:1-5:1**
|
|
10×ligation
buffer
|
1 μl
|
1×
|
|
T4 DNA
ligase(5U/μl)
|
0.5 μl
|
2.5 U
|
|
50% PEG
solution
|
1 μl
|
5%
|
|
ddH2O
|
up to 10 μl
|
|
*：平滑末端的載體與 DNA 片段進行連接時，應首先(xian)將載體進行去磷酸化(hua)處理，以(yi)防止其自身環化(hua)。
**：載(zai)體(ti)(ti)與插(cha)入(ru)片(pian)(pian)段的(de)摩(mo)爾數(shu)比(bi)需(xu)要(yao)優化：一(yi)般vector:insert在(zai)1:1~1:5之(zhi)間均可得到較好(hao)的(de)結(jie)果(guo)。用(yong)(yong)以下公(gong)式計算片(pian)(pian)段摩(mo)爾數(shu)：pmol數(shu)= DNA量(ng)/(660×片(pian)(pian)段bp數(shu))×1000。例如：插(cha)入(ru)片(pian)(pian)段2000bp，線性載(zai)體(ti)(ti)為(wei)3000bp，如果(guo)載(zai)體(ti)(ti)使用(yong)(yong)量為(wei)50ng（0.025pmol），10μl連接體(ti)(ti)系中(zhong)vector:insert的(de)摩(mo)爾比(bi)是1:3，則(ze)需(xu)要(yao)2000bp pmol數(shu)為(wei)0.075pmol，插(cha)入(ru)片(pian)(pian)段2000bp的(de)使用(yong)(yong)量為(wei)100ng。
2．徹底(di)輕柔混勻后(hou)，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到(dao)管底(di)。
3．反應條件(jian)：16℃孵(fu)育(yu)30分鐘。
4．可取(qu)5
μl連接產(chan)物熱擊轉化50
μl感受態(tai)細胞或(huo)取(qu)1-2
μl連接產(chan)物電擊轉化50
μl感受態(tai)細胞。
注：1）由(you)于平末端連接體系中，T4 ligase用量較大(da)，若要提(ti)高電(dian)轉實驗效率，推薦65℃孵育(yu)10分鐘或70℃孵育5分鐘(zhong)以滅活(huo)T4
DNA Ligase后(hou)，用DNA產物純化(hua)(hua)試(shi)劑盒或氯仿抽提(ti)對連(lian)接后(hou)的(de)DNA片段進行純化(hua)(hua)后(hou)才能(neng)進行電擊轉化(hua)(hua)。
2）若要提高轉(zhuan)化子(zi)數目，可將(jiang)連接時間延長至(zhi)1小(xiao)時。
二 線性DNA的(de)自身環(huan)化
1．反應(ying)體系:
|
|
50μl體系
|
終濃度(du)
|
|
線性載體(ti)DNA
|
x μl
|
10-50 ng
|
|
10×ligation
buffer
|
5 μl
|
1×
|
|
T4 DNA
ligase(5U/μl)
|
1 μl
|
5 U
|
|
ddH2O
|
up to 50 μl
|
|
2．徹底輕柔混勻后(hou)，瞬間(jian)離心，將(jiang)管壁上的(de)溶液收集到管底。
3．反應條(tiao)件(jian)：16℃孵(fu)育30分鐘(zhong)。
4．可取5
μl連(lian)接產物熱擊轉化50
μl感(gan)受態細胞或取1-2
μl連(lian)接產物電擊轉化50
μl感(gan)受態細胞。
注：1）若(ruo)要提(ti)高電轉(zhuan)實驗效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase后(hou)(hou)，用DNA產(chan)物純(chun)化(hua)試劑盒或氯仿抽提對連接后(hou)(hou)的DNA片段(duan)進(jin)(jin)行純(chun)化(hua)后(hou)(hou)才能進(jin)(jin)行電擊轉化(hua)。
三 接頭連接
1．反(fan)應體系:
|
|
20μl體系
|
終濃度(du)
|
|
線性DNA
|
x μl
|
100-500 ng
|
|
磷酸化接(jie)頭
|
y μl
|
1-2 μg
|
|
10×ligation
buffer
|
2 μl
|
1×
|
|
50% PEG
solution
|
2 μl
|
5%
|
|
T4 DNA
ligase(5U/μl)
|
0.4 μl
|
2 U
|
|
ddH2O
|
up to 20 μl
|
|
2．徹底輕柔混勻(yun)后，瞬間離(li)心，將(jiang)管壁上的溶液(ye)收集到管底。
3．反應條件：16℃孵育30分鐘。
4．65℃孵育10分鐘(zhong)或70℃孵育5分鐘(zhong)滅活T4
DNA Ligase。連(lian)接產物可以直接進(jin)行限制性內(nei)切酶(mei)酶(mei)切反(fan)應(ying)。