DNase I（RNase-free）
● 產品組成(cheng)：
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貨號
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名稱
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規(gui)格(ge)
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RTT2104-01
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DNase
I （RNase-free） 1 U/μl
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200 U
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RTT2104-02
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10×DNase
Reaction Buffer
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0.2 ml
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RTT2104-03
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10×EDTA終(zhong)止液（25
mM）
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0.2 ml
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-
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RNase-free水
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1 ml
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● 保存： -20℃貯存，有效期一年。
● 產品簡(jian)介：
DNase I，即Deoxyribonuclease
I，中文名稱為脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶。DNase
I水解單鏈或雙鏈DNA后的產物，5'端為磷酸基團，3'端為羥基。 DNase I活性依賴于(yu)鈣離(li)子(zi)(zi)，并能(neng)被鎂離(li)子(zi)(zi)或二價錳(meng)離(li)子(zi)(zi)激(ji)活。鎂離(li)子(zi)(zi)存在(zai)條(tiao)件下，
DNase I可(ke)隨機剪切(qie)雙鏈DNA的(de)任意位(wei)點；二價錳(meng)離(li)子(zi)(zi)存在(zai)條(tiao)件下，DNase
I 可(ke)在(zai)同一位(wei)點剪切(qie)DNA雙鏈，形成平末(mo)端(duan)，或1-2個核苷酸(suan)突出的(de)粘末(mo)端(duan)。該DNase I不含RNase
(RNase free)，可(ke)以用(yong)(yong)于(yu)各種RNA樣品的(de)處(chu)理。提供了(le)用(yong)(yong)于(yu)DNase I失活所(suo)需(xu)的(de)EDTA。
用途：制備不(bu)含DNA的(de)RNA樣品；RT-PCR反應前(qian)RNA樣品中(zhong)去除基(ji)因(yin)組(zu)DNA等可能的(de)DNA污(wu)染；體(ti)外T7, T3, SP6等RNA
Polymerases催化(hua)的(de)RNA轉(zhuan)錄后去除DNA模板；DNase
I footprinting研究(jiu)DNA-蛋白質相互(hu)作(zuo)用；缺口(kou)平移(nick
translatioin)；產(chan)生DNA隨機片段文庫；細胞凋亡TUNEL檢測(ce)中(zhong)部分剪切基(ji)因(yin)組(zu)DNA作(zuo)為(wei)陽性對(dui)照(zhao)。
● 活性定義：
One unit of
the enzyme completely degrades 1 μg of DNA in 10 min at37°C.
● DNaseI貯存緩沖液(ye)：
50mM
Tris-acetate (pH7.5)，10mM CaCl2，50% (v/v) glycerol
10×DNase Reaction Buffer：100m M Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，25mM MgCl2，1mM CaCl2
● DNaseI失活或抑制：
加入EDTA至終(zhong)濃(nong)度為(wei)2.5mM后(hou)，65℃加熱10分(fen)鐘可(ke)使(shi)DNase I失活。酚(fen)氯仿抽提也可(ke)以使(shi)DNase I失活。金屬離(li)子(zi)螯(ao)合劑，達到毫(hao)摩爾/升濃(nong)度的(de)鋅離(li)子(zi)，0.1%的(de)SDS，DTT、巰基乙(yi)醇等還原劑，50-100mM以上(shang)鹽(yan)濃(nong)度均對DNase I有顯著抑制作用。
● 使用方法：
一 RT-PCR反應前RNA樣品中DNA的去除：
1.在RNase-free離(li)心管中加入以下溶液(ye)：
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組份
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10μl反應體系
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備(bei)注
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RNA溶液
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1-3
μg
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RNA加入體積小于(yu)8
μl
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10×DNase Reaction
Buffer
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1
μl
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DNase I (RNase-free) 1 U/μl
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1
μl
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RNase-free水
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補至10μl
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輕柔混勻(yun)
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2.
37oC
孵育
30 分鐘。
3.
向上述反應體系中加入
1μl 10×EDTA終止液，65oC
孵育
10 分鐘以(yi)失活
DNase I。
注(zhu)：在沒(mei)有鏊(ao)合(he)劑如
EDTA存在情況(kuang)下加熱，RNA
可被(bei)水(shui)解。
4.
RNA樣品即(ji)可直接(jie)用作RT-PCR反應的模板。
二 體外RNA反轉錄后模板DNA的去除：
1. ; 在每含有0.5 μg模板DNA的反轉錄反應體系(xi)中加入1U DNase I。
注：在某(mou)些情況下，模(mo)板DNA完全(quan)消化所(suo)需(xu)的DNase的量需(xu)通過(guo)實(shi)驗進行(xing)摸索。
2. 37oC
孵育15分(fen)鐘(zhong)。
3. 酚/氯仿抽提失活(huo)DNase I。
三 體外RNA反轉錄后模板DNA的去除：
1. 參考如下表格設(she)置(zhi)反應體系：
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組(zu)份
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體積
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10×Reaction
Buffer for DNA Polymerase I
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2.5
μl
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3
dNTP Mixture (1mM each, without the
labeled dNTP) *
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1.25
μl
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[α-32P]-dNTP,
~110TBq/mmol (3000Ci/mmol)
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1.85-3.7MBq
(50-100μCi)
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DNase
I (freshly diluted to 0.002U/μl)**
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1
μl
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DNA
Polymerase I, E.coli
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0.
5-1.5 μl (5-15 U)
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Template
DNA
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0.25μg
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RNase-free水
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至25μl
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*3
dNTP Mixture (1mM each, without the
labeled dNTP)：分別(bie)取不含已經標(biao)記的(de) dNTP 外(wai)的(de) 3 種(zhong) dNTP(100mM) 各 1μl 加入到 97 μl 的(de)RNase-free水中混勻即可。例如標(biao)記的(de)為
dATP，則需混合(he)
dTTP、dCTP
和(he)
dGTP 三種(zhong)
dNTP 至每種(zhong)的(de)最(zui)終(zhong)濃(nong)度(du)為
1 mM。配(pei)制好的(de)
dNTP 可存放于-20oC
以備后續使用。
**DNase
I 可以用(yong)
1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進行稀釋。
10×Reaction
Buffer for DNA Polymerase I：500mM Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，100mM
MgCl2，10mM DTT。
2.
立即
15oC 孵(fu)育
15~60 分(fen)鐘。
3.
上述反應體系中加入1
μl of 0.5M EDTA(pH 8.0)終(zhong)止反應。
4.
從中取出少量例如1
μl 檢測標記效率。通常標記效率至少可以達到
108cpm/μg DNA。