植物原生質體制備及轉化試劑盒
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貨號
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名稱
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包裝(zhuang)
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RTU4052
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植物原(yuan)生質體制備及(ji)轉化(hua)試劑(ji)盒
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5 ml×40次
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● 產品組成：
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組分貨號
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名稱
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規格
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貯存(cun)
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運輸
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RTU4052-01
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溶液I-酶溶解(jie)溶液(ye)（2×）
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100 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-02
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溶液(ye)II-漂(piao)洗溶液
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200 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-03
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溶液III-重懸溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-04
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組份IV-轉化試劑
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5 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-05
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溶液(ye)V-培養溶(rong)液
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25 ml
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-20℃
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RT
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BME
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還原劑(ji)
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1 ml
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RT
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RT
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BSA-02
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50mg/ml BSA溶液
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5 ml
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-20℃
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RT
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說明書(shu)
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一份
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● 產品簡介：
植物原生質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到原生質體。許多方法可誘導原生質體融合，現在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進行清洗，使原生(sheng)質體融合得(de)以(yi)完成。
按照每次使用5
ml酶消化(hua)體系(xi)計算，本試(shi)劑盒可(ke)用于40次酶消化(hua)反(fan)應。本試(shi)劑盒每個(ge)(ge)(ge)5 ml反(fan)應體系(xi)可(ke)處理(li)0.1 g左右的擬南芥葉(xie)片(約10~15葉(xie)片)，操作(zuo)(zuo)較好的情況下每5 ml體系(xi)可(ke)獲得約50-70萬個(ge)(ge)(ge)原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(不(bu)(bu)同植物不(bu)(bu)同操作(zuo)(zuo)會有(you)一定的差異)，可(ke)滿足約25-70個(ge)(ge)(ge)樣品的原(yuan)生(sheng)質(zhi)體質(zhi)粒轉染操作(zuo)(zuo)(按照每樣1-2萬個(ge)(ge)(ge)細胞計算)。
原生質體轉化時，本試劑盒(he)可以用于相當于6孔(kong)(kong)板(ban)40個(ge)孔(kong)(kong)的樣品，12孔(kong)(kong)板(ban)80個(ge)孔(kong)(kong)的樣品，或24孔(kong)(kong)板(ban)160個(ge)孔(kong)(kong)的樣品的轉化。
● 貯存和效期：
-20oC保存，至少一年有(you)效。
組分I，II，III，V 4℃存放3-5天不會影響使用效果，長期不用，按照標簽℃貯存。
試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
需要準備的材料（試劑盒不提供）：
剪尖吸頭(tou)（剪尖后可以用酒精燈過(guo)火將吸頭(tou)處理平(ping)(ping)滑）；纖維素酶R-10；離析(xi)酶R-10；平(ping)(ping)頭(tou)鑷子；70μm細胞過(guo)濾(lv)篩(shai)；一次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水浴(yu)鍋。
一、原生質體分離：
即用型酶溶(rong)液配制
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5 ml配制量(liang)
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10 ml 配制量
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溶液I（2×）
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2.5
ml
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5
ml
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纖維(wei)素酶R-10
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0.075克
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0.15 克
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離析酶R-10
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0.02 克
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0.04 克(ke)
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混勻后(hou) 55℃水浴 10 min，期間顛倒混勻 2-3次，冷卻至常溫后加入以下成分(fen)。
注(zhu)：55oC孵育可以有效滅活DNase和Protease，并促進酶溶解(jie)
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還(huan)原劑(ji)
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2.5
μl
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5
μl
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50mg/ml
BSA
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0.1
ml
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0.2
ml
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滅菌水
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定容至(zhi)5 ml
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定容至10 ml
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注：即用型酶溶液現用現配，不建議配制后凍存后再使用；
溶解好的正常酶溶液應為澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。
1. 酶解：
取生長狀態良好(hao)的葉片(pian)切成(cheng)0.5-1 mm的小(xiao)條(tiao)，按照(zhao)0.1
克葉片(pian)（擬南(nan)芥約(yue)15-20個葉片(pian)）加5
ml即用型酶(mei)(mei)溶液的比例迅速將切割好(hao)的葉片(pian)小(xiao)條(tiao)浸泡于酶(mei)(mei)溶液中，避(bi)光，無需震(zhen)蕩，常溫（20-25℃）酶(mei)(mei)解3小(xiao)時，間歇混勻。
注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態有關，請根據實驗需要適當調整酶解時間。3小時為擬南芥葉片推薦的酶解時間。如條件允許，可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min，以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變為綠色表明有原生質體已經有分離，溶液為濃綠色表明原生質體已經大量分離。擬南芥原生質體大小約為30-50 μm，顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質體細胞顯微鏡下為綠色圓球狀，葉綠體分散在整個細胞內，說明狀態較好；如呈現不規則形狀，說明原生質體破碎(sui)或即將破碎(sui)。
2. 漂洗：
酶解后加(jia)入等(deng)體積的溶液II，如使用(yong)5 ml酶解體系，加(jia)入5 ml溶液II，輕(qing)柔混勻。
3. 過濾：
用孔徑70 μm篩(shai)網過濾(lv)步(bu)驟2中(zhong)的溶液(ye)，去除未消化的葉片，收集濾(lv)出液(ye)于50 ml離(li)心(xin)管中(zhong)。
4. 第一次收集：
濾出液100g常溫離心(xin) 2分鐘(zhong)，盡量去除上(shang)清。
注：為了避免原生(sheng)質體(ti)離心(xin)時貼在(zai)管(guan)(guan)壁(bi)，建議整個實驗(yan)過(guo)程使(shi)用水平轉頭；離心(xin)時，可(ke)(ke)調低離心(xin)機的升速和(he)降速。升速過(guo)快(kuai)，原生(sheng)質體(ti)可(ke)(ke)能離到(dao)管(guan)(guan)壁(bi)上；降速過(guo)快(kuai)，可(ke)(ke)能導致管(guan)(guan)底原生(sheng)質體(ti)懸起。
5. 第二次收集：
加入2-5 ml 溶液(ye)II，用剪尖的藍吸頭重懸原(yuan)生(sheng)質體(ti)，冰浴30分鐘，原(yuan)生(sheng)質體(ti)在重力作用下可以沉(chen)(chen)降到離(li)(li)心管底部，盡(jin)量吸除(chu)上(shang)清(qing)，收集原(yuan)生(sheng)質體(ti)。(如果發現原(yuan)生(sheng)質體(ti)沉(chen)(chen)降的速度(du)比較慢或者(zhe)得(de)率比較低(di)，也(ye)可以考慮常(chang)溫100 g離(li)(li)心1-2 min收集原(yuan)生(sheng)質體(ti))。
6. 重懸：
小心去除上清溶液，不要觸動原生質體沉淀，沉淀用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即為原生質體溶液。（可以用血球計數板計數，根據原生質體數量調整溶液III的加入體積，使得原生質體密度為2×105/ml或更(geng)高(gao)）。
注：制備好的原生質體可以在4oC或(huo)冰浴保存至少24 h。
二、原生質體轉化和培養：
1. 轉化溶液配制：
植物(wu)原生(sheng)質體轉化參(can)考下表(biao)根據樣品(pin)量配制轉化溶液。
轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時配制，以確保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制后盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之內仍然有(you)較好的(de)轉(zhuan)化(hua)效率，但和當(dang)天配制的(de)轉(zhuan)化(hua)溶液相比，轉(zhuan)化(hua)效果(guo)可能會有(you)一定程度的(de)下降。
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120 μl
（1個樣品）
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1.2 ml
（10個樣品）
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5 ml
(約(yue)40個樣(yang)品)
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轉(zhuan)化試劑粉末
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48
mg
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480
mg
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2
g
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轉化試(shi)劑溶解液(ye)（2×）
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60
μl
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0.6
ml
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2.5
ml
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滅菌(jun)水
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定容(rong)至(zhi)120 μl
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定(ding)容至1.2 ml
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定容至5 ml
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2. 準備質粒：
取(qu)10 μl質粒(li)DNA(10-20
μg，濃(nong)度為(wei)1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管(guan)中。
注：質粒大小(xiao)建議為(wei)5-10
kb，質粒濃度(du)為(wei)1-2 μg/μl左右；
原生質體(ti)轉化對于質粒(li)的純度(du)要求較高(gao)，盡量使用高(gao)純度(du)的質粒(li)。
3. 質粒轉化：
3.1 質粒管中加入100 μl原生質體溶液（原生質體密度為2×105/ml，約2萬(wan)個原生質體），輕柔混勻。
3.2 加入等體(ti)積即110 μl 步驟(zou)1事先準備好的轉化(hua)溶液，輕(qing)彈管底，輕(qing)柔(rou)混(hun)勻，常溫25℃放(fang)置5-15分(fen)鐘(zhong)。
注(zhu)：最(zui)長(chang)可以孵育15 min，但(dan)通常孵育5min時間(jian)已經足(zu)夠。最(zui)佳的孵育時間(jian)對于不同(tong)(tong)的原生質體和(he)不同(tong)(tong)的質粒需要通過實驗摸索。
4. 終止轉化：
加(jia)入2倍體(ti)積即440 μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉化過程(cheng)。
5. 收集原生質體：
常溫(wen)100g離(li)心1-2分鐘，盡量去(qu)除上(shang)清。
注(zhu)：由于轉化后(hou)的溶(rong)液(ye)會非(fei)常粘稠，加入溶(rong)液(ye)II后(hou)離心1
min通常可(ke)以使原(yuan)(yuan)生(sheng)質體(ti)聚集在管底(di)，但使用某些(xie)突變體(ti)時為減少(shao)原(yuan)(yuan)生(sheng)質體(ti)損失，可(ke)將離心時間延長到2 min。
6. 原生質體漂洗：
加入500 μl溶液II輕(qing)輕(qing)重懸原生質體，常(chang)溫100g離心(xin)1 min，盡量去(qu)除(chu)殘留(liu)的(de)上清(qing)。注：本(ben)步驟可(ke)以充分(fen)去(qu)除(chu)殘留(liu)的(de)轉(zhuan)染試劑溶液中(zhong)(zhong)的(de)組分(fen)，避免轉(zhuan)染試劑溶液中(zhong)(zhong)的(de)組分(fen)對于后續(xu)的(de)不良影響。
7. 原生質體重懸：
沉淀中加入1
ml溶液V，輕柔重(zhong)懸(xuan)。
8. 原生質體培養：
將離心管水(shui)平放置，23-25oC弱光培養。
注：根據(ju)實(shi)驗(yan)(yan)需求(qiu)確定(ding)孵育(yu)時間。RNA分(fen)析孵育(yu)2-6小時；酶活性(xing)分(fen)析和蛋白標記實(shi)驗(yan)(yan)孵育(yu)2-16小時；基因編輯的效果(guo)在轉染(ran)24小時后可能被檢測到。
三、實驗示例：
使用(yong)原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)植物原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)制備及轉化試(shi)劑(ji)盒轉染擬(ni)南芥原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)的(de)效果圖(tu)。
實驗步驟(zou)：稱取0.48
g轉(zhuan)(zhuan)化(hua)試(shi)劑(ji)于(yu)2 ml 離心(xin)管(guan)中，加(jia)(jia)入(ru)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)試(shi)劑(ji)溶(rong)解液(ye)后(hou)(hou)，顛(dian)(dian)倒混(hun)(hun)勻(yun)(yun)，蒸餾(liu)水定容至2 ml，使轉(zhuan)(zhuan)化(hua)試(shi)劑(ji)充分溶(rong)解后(hou)(hou)備用(yong)。在2 ml的(de)(de)圓底離心(xin)管(guan)中加(jia)(jia)入(ru)10 μl（20 μg）EGFP質粒
(植物(wu)用(yong)綠(lv)色熒光(guang)蛋白)，加(jia)(jia)入(ru)100 μl制備好的(de)(de)原生(sheng)質體(ti)，輕柔(rou)混(hun)(hun)勻(yun)(yun)后(hou)(hou)加(jia)(jia)入(ru)110 μl當(dang)日(ri)配制好的(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)試(shi)劑(ji)溶(rong)液(ye)，輕柔(rou)混(hun)(hun)勻(yun)(yun)，常溫靜置(zhi)5
min后(hou)(hou)加(jia)(jia)入(ru)440 μl溶(rong)液(ye)II終止轉(zhuan)(zhuan)化(hua)，輕輕顛(dian)(dian)倒混(hun)(hun)勻(yun)(yun)，常溫100 g離心(xin)1 min，去(qu)除(chu)上清(qing)，再加(jia)(jia)入(ru)0.5 ml溶(rong)液(ye)II，輕柔(rou)重懸原生(sheng)質體(ti)，常溫100 g離心(xin)1 min后(hou)(hou)，盡(jin)量去(qu)除(chu)上清(qing)，收集原生(sheng)質體(ti)。加(jia)(jia)入(ru)1 ml溶(rong)液(ye)V，小心(xin)重懸原生(sheng)質體(ti)后(hou)(hou)水平放置(zhi)25℃培養過夜(約(yue)16h)，次日(ri)于(yu)熒光(guang)顯微鏡下檢測(ce)EGFP熒光(guang)信號。
植物原生質體提取試劑盒發表文章列表（15篇）
1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a
-expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid
responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.
實驗植物：小麥
Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina
Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li,
Baozhong Hu.
Journal: J Plant Physiology 2019
Institution： College
of Life Sciences, Northeast Agricultural University
Paper link：
2. [IF=5.36] Involvement of the
chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to
Potato virus X infection.
實驗植物：煙草
Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang,
Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng,
Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,
Jianping Chen and Fei Yan
Journal: Journal of Experimental
Botany, 2020，Vol.71,
No. 6,2142–2156,
Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：
3. [IF=7.228] Turnip mosaic
virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection
實驗植物：煙草
Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu,
Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng,
Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan
Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30
July
Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：
4. [IF=5.64] A Novel, Small
Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger
Plant Cell Death
實驗植物：水稻
Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin,
Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng
Journal: Fronties in Microbiology August
2021 | Volume 12 | Article 684923
Institution：Sichuan
Agricultural University
Paper link：
5. [IF=9.8] Synthesis of
flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in
DNA methylation during peach fruit ripening
實驗植物：煙草
Author: Chunyan Wei, Hongru Liu,
Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang
Journal: Plant Biotechnology
Journal (2021) 19, pp. 2082–2096
Institution：Laboratory
of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural
Plant Integrative Biology, Zhejiang University
Paper link：
6. [2020IF=1.04] EoPHR2, a
Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving
Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides
實驗植物：擬南芥
Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang
Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2,
Shenghao Zhou3, Haoran Wang
Journal: Phyton Vol.91, No.3,
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Institution： Institute
of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences
Paper link：
7. [2021IF=3.2] Establishment
and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus
pluvia
實驗材料：雨生紅球藻 Haematococcus
pluvia
Author: Chunli Guo，Muhammad
Anwar， Rui Mei，Xinyi
Li， Di Zhao，Yanan
Jiang， Jieyi
Zhuang， Chen Liu，Chaogang
Wang， Zhangli
Hu
Journal: Journal of Applied
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online 07 March 2022
Institution：College
of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University
Paper link：
8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide
Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in
Nelumbo nucifera Gaertn
實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn
Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang,
Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding
Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.
Institution：College
of Life Sciences, Guizhou University，College
of Life Sciences, Wuhan University
Paper link： //www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901
9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association
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domainprotein for pathogen resistance in cotton
實驗材料：棉花
Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang,
Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan
Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang
Journal: Genome Biology (2023) 24:111
Institution：Institute
of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences
Paper link： //doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9
10. [2022
IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating
ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L
實驗材料：Rose 玫瑰
Author: Chen
Yeqing ,Lu Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo
,Yuan Guozhen ,Sun Jingjing ,Liu Jinyi ,Wang Changquan
Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023
Institution：College
of Horticulture, Nanjing Agricultural University
Paper link：
11. [2022
IF=17.4] Functionalized carbon nano-enabled plant ROS signal engineering for
growth / defense balance
實驗材料：擬南芥
Author: Zhijiang
Guo , Qiong Chen , Taibo Liang , Baoyuan Zhou , Suhua Huang , Xiufeng Cao,
Xiuli Wang , Zaisong Ding, Jiangping Tu
Journal: Nano Today 53 (2023) 102045
Institution：School
of Materials Science and Engineering, Zhejiang University
Paper link：
12. [2022
IF=13.8] Unveiling the mechanism of broad-spectrum blast resistance in rice:
The collaborative role of transcription factor OsGRAS30 and histone deacetylase
OsHDAC1
實驗材料：水稻
Author: Jiaqi
Hou, Huangzhuo Xiao, Peng Yao, Xiaoci Ma, Qipeng Shi, Jin Yang, Haoli Hou and
Lijia Li
Journal: Plant Biotechnology Journal (2024), pp. 1–17
Institution：State
Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University
Paper link：
13. [2022
IF=7.2] NnSnRK1-NnATG1-mediated autophagic cell death governs flower bud
abortion in shaded lotus
實驗材料：荷花
Author: Xiehongsheng
Li, Yingchun Xu, Zongyao Wei, Jiaying Kuang, Mingzhao She, Yanjie Wang and
Qijiang Jin
Journal: Plant J (2024) 117, 979–998
Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University
Paper link：
14. [2022
IF=7.5] The dynamic TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90 complex modulates
NLR-protein-mediated antiviral immunity in wheat.
實驗材料：小麥
Author: Haichao
Hu, Tianye Zhang, Jinnan Wang, Jun Guo, Yaoyao Jiang, Qiansheng Liao, Lu Chen,
Qisen Lu,Peng Liu, Kaili Zhong, Jiaqian Liu, Jianping Chen, Jian Yang
Journal: Cell Reports 43, 114765, October 22,
2024
Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：
15.
[2023 IF=14.3] Natural SNP Variation in GbOSM1 Promotor Enhances Verticillium Wilt
Resistance in Cotton.
實驗材料：棉花
Author: Guilin Wang, Dayong Zhang,
Haitang Wang, Jinmin Kong, Zhiguo Chen, Chaofeng Ruan, Chaoyang Deng, Qihang
Zheng, Zhan Guo, Hanqiao Liu, Weixi Li, Xinyu Wang,and Wangzhen Guo
Journal: Advanced Science 2024, 2406522
Institution：Nanjing
Agricultural University
Paper link：