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植物原生質體制備及轉化試劑盒plus                           

●  產品組成：

● 產品簡介：

植物原生質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到原生質體。許多方法可誘導原生質體融合，現在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進行清洗，使(shi)原生質體(ti)融合得以完成。

按照每(mei)次(ci)使(shi)用5 ml酶消化(hua)體(ti)(ti)系計算(suan)，本試(shi)劑盒可用于(yu)40次(ci)酶消化(hua)反應(ying)。本試(shi)劑盒每(mei)個5 ml反應(ying)體(ti)(ti)系可處理0.1 g左右的(de)擬(ni)南芥葉片(約(yue)10~15葉片)，操(cao)(cao)作較好的(de)情況(kuang)下每(mei)5 ml體(ti)(ti)系可獲(huo)得約(yue)50-70萬(wan)個原生質體(ti)(ti)(不(bu)同(tong)植物不(bu)同(tong)操(cao)(cao)作會有一(yi)定的(de)差異)，可滿足約(yue)25-70個樣品(pin)的(de)原生質體(ti)(ti)質粒(li)轉(zhuan)染操(cao)(cao)作(按照每(mei)個樣品(pin)1-2萬(wan)個細胞計算(suan))。

原(yuan)生質體轉化時，本試劑(ji)盒可以用于相當于6孔板(ban)40個孔的樣品，12孔板(ban)80個孔的樣品，或24孔板(ban)160個孔的樣品的轉化。

● 貯存和效期：

-20oC保存，至少一年有效。

組分I，II，III，V  4℃存放3-5天不會影響使用效果，長期不用，按照標簽℃貯存。

試劑盒常溫運輸。

● 使用說明：

   需要準備的材料（試劑盒不提供）：

   剪尖吸頭(tou)（剪尖后可以用酒精燈(deng)過火將(jiang)吸頭(tou)處(chu)理平滑）；平頭(tou)鑷(nie)子；70 μm細胞過濾篩；一次性刀片(pian)；50 ml離(li)心(xin)管(guan)；1.5 ml離(li)心(xin)管(guan)；水浴鍋。

一、原生質體分離：

即用(yong)型酶溶液配制

注：即用型酶溶液現用現配，不建議配制后凍存后再使用；

溶解好的正常酶溶液應為澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。

1. 酶解：

取生長狀態良好的(de)(de)葉片(pian)切成0.5-1 mm的(de)(de)小條(tiao)，按照0.1 克(ke)葉片(pian)（擬南芥約15-20個葉片(pian)）加5 ml即用(yong)型酶溶液(ye)的(de)(de)比例迅速將切割好的(de)(de)葉片(pian)小條(tiao)浸泡于酶溶液(ye)中，避光，無需震蕩，常溫(wen)（20-25℃）酶解3小時，間歇混勻。

注(zhu)：酶(mei)(mei)解(jie)時間(jian)(jian)與葉(xie)片(pian)種類(lei)，葉(xie)片(pian)生長狀態有關，請(qing)根據(ju)實(shi)驗(yan)需要適當調整酶(mei)(mei)解(jie)時間(jian)(jian)。3小(xiao)時為(wei)(wei)擬南芥葉(xie)片(pian)推薦(jian)的酶(mei)(mei)解(jie)時間(jian)(jian)。如(ru)(ru)條(tiao)(tiao)件(jian)允許(xu)，可以(yi)使用微型真空(kong)泵常溫避光條(tiao)(tiao)件(jian)下抽(chou)真空(kong)30 min，以(yi)使酶(mei)(mei)溶(rong)液(ye)更(geng)好地(di)進入細胞間(jian)(jian)隙。酶(mei)(mei)溶(rong)液(ye)變(bian)為(wei)(wei)綠(lv)色(se)表(biao)明(ming)有原生質(zhi)體已(yi)經有分(fen)離，溶(rong)液(ye)為(wei)(wei)濃綠(lv)色(se)表(biao)明(ming)原生質(zhi)體已(yi)經大(da)量分(fen)離。擬南芥原生質(zhi)體大(da)小(xiao)約(yue)為(wei)(wei)30-50 μm，顯(xian)(xian)微鏡鏡檢(jian)后確定是否分(fen)離。葉(xie)片(pian)原生質(zhi)體細胞顯(xian)(xian)微鏡下為(wei)(wei)綠(lv)色(se)圓球狀，葉(xie)綠(lv)體分(fen)散(san)在整個(ge)細胞內，說(shuo)明(ming)狀態較好；如(ru)(ru)呈現不規則形(xing)狀，說(shuo)明(ming)原生質(zhi)

體破碎或即將破碎。

  2. 漂洗：

酶解(jie)后加入等體積的(de)溶(rong)液II，如使用5 ml酶解(jie)體系，加入5 ml溶(rong)液II，輕柔混(hun)勻。

3. 過濾：

用孔(kong)徑70 μm篩(shai)網過濾步驟(zou)2中的溶(rong)液(ye)，去除未消化的葉片(pian)，收(shou)集(ji)濾出液(ye)于(yu)50 ml離心管中。

4. 第一次收集：

濾出液100g常溫離心 2分(fen)鐘，盡(jin)量去除上清。

 注(zhu)：為了避免原(yuan)(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)離心時(shi)貼在管(guan)(guan)壁(bi)，建(jian)議整(zheng)個實驗過(guo)(guo)程使用水平轉頭；離心時(shi)，可(ke)(ke)調低離心機的升速和(he)降速。升速過(guo)(guo)快，原(yuan)(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)可(ke)(ke)能離到管(guan)(guan)壁(bi)上；降速過(guo)(guo)快，可(ke)(ke)能導致管(guan)(guan)底原(yuan)(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)懸起(qi)。

5. 第二次收集：

加(jia)入2-5 ml 溶液(ye)II，用(yong)(yong)剪(jian)尖的(de)藍吸頭重(zhong)懸原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)(ti)，冰(bing)浴30分鐘，原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)(ti)在重(zhong)力(li)作用(yong)(yong)下可以(yi)沉降(jiang)到離(li)(li)心(xin)管底部，盡量(liang)吸除上清，收集原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)(ti)。(如果(guo)發現原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)(ti)沉降(jiang)的(de)速度比(bi)較(jiao)慢或者得率比(bi)較(jiao)低(di)，也可以(yi)考慮常(chang)溫(wen)100 g離(li)(li)心(xin)1-2 min收集原(yuan)(yuan)生(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)(ti))。

6. 重懸：

小心去除上清溶液，不要觸動原生質體沉淀，沉淀用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即為原生質體溶液。（可以用血球計數板計數，根據原生質體數量調整溶液III的加入體積，使得原生質體密度為2×10⁵/ml或更高）。

注：制備好(hao)的(de)原生質體可(ke)以在4oC或冰浴保存至(zhi)少(shao)24 h。

二、原生質體轉化和培養：

  1. 轉化溶液配制：

植物(wu)原生(sheng)質體轉化參考下表根據(ju)樣品量配制轉化溶液。

轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時配制，以確保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制后盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之內仍(reng)然有(you)較好的轉化效(xiao)率，但(dan)和當天配制的轉化溶液相比，轉化效(xiao)果可能會有(you)一(yi)定程度的下(xia)降。

2. 準備質粒：

取(qu)10 μl質(zhi)粒DNA(10-20 μg，濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。

注：質粒(li)大小建議為(wei)5-10 kb，質粒(li)濃度為(wei)1-2 μg/μl左右； 

原生質體轉化對于質粒的純(chun)度(du)要求(qiu)較高(gao)，盡量(liang)使用高(gao)純(chun)度(du)的質粒。

3. 質粒轉化：

3.1 質粒管中加入100 μl原生質體溶液（原生質體密度為2×10⁵/ml，約2萬個原生(sheng)質(zhi)體），輕柔(rou)混勻。

3.2 加入(ru)等(deng)體(ti)積即110 μl 步驟1事先準備(bei)好的轉(zhuan)化溶液，輕彈管底，輕柔混(hun)勻，常溫(wen)25℃放(fang)置(zhi)5-15分鐘。

注：最長可以孵(fu)育(yu)15 min，但通常(chang)孵(fu)育(yu)5min時間(jian)已經(jing)足夠。最佳的(de)孵(fu)育(yu)時間(jian)對(dui)于不同(tong)的(de)原生質體(ti)和不同(tong)的(de)質粒需(xu)要通過實(shi)驗(yan)摸索。

4. 終止轉化：

 加入2倍體積即440 μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉化(hua)過程(cheng)。

5. 收集原生質體：

常(chang)溫(wen)100g離心1-2分鐘，盡量去(qu)除(chu)上清。

注：由于轉化后的溶(rong)(rong)液會非常(chang)粘稠(chou)，加入溶(rong)(rong)液II后離心(xin)1 min通常(chang)可以使(shi)(shi)原生質體聚集在管底，但使(shi)(shi)用某些突(tu)變體時(shi)為減少(shao)原生質體損失，可將離心(xin)時(shi)間延長(chang)到2 min。

6. 原生質體漂洗：

  加入500 μl溶液II用剪尖藍吸頭輕輕重懸原生質體，常(chang)溫(wen)100g離心1 min，盡(jin)量(liang)去除殘(can)留的上清(qing)。

注：本(ben)步驟(zou)可以充分去除殘留(liu)的(de)(de)轉(zhuan)染試(shi)劑溶(rong)液中的(de)(de)組分，避免轉(zhuan)染試(shi)劑溶(rong)液中的(de)(de)組分對于(yu)后續的(de)(de)不良影響。

7. 原生質體重懸：

沉淀中(zhong)加入1 ml溶液V，用剪尖藍吸頭輕柔重懸。

8. 原生質體培養：

將離(li)心(xin)管水(shui)平放置，23-25oC弱光培養(yang)。

注：根據實(shi)驗需(xu)求確定孵(fu)育時(shi)(shi)間。RNA分析(xi)孵(fu)育2-6小(xiao)時(shi)(shi)；酶活(huo)性分析(xi)和蛋白標記實(shi)驗孵(fu)育2-16小(xiao)時(shi)(shi)；基因編輯的(de)效果在轉(zhuan)染24小(xiao)時(shi)(shi)后(hou)可(ke)能(neng)被檢測到。

三、實驗示例：

使用(yong)原生(sheng)質體(ti)植物原生(sheng)質體(ti)制備及轉化試劑盒轉染擬(ni)南(nan)芥原生(sheng)質體(ti)的(de)效果(guo)圖。

實(shi)驗步驟：稱取0.48 g轉(zhuan)化(hua)試(shi)劑于2 ml 離心(xin)管中，加(jia)(jia)入(ru)轉(zhuan)化(hua)試(shi)劑溶解液(ye)(ye)后(hou)，顛倒混(hun)勻(yun)，蒸餾(liu)水定容至2 ml，使轉(zhuan)化(hua)試(shi)劑充分溶解后(hou)備(bei)用。在2 ml的圓底(di)離心(xin)管中加(jia)(jia)入(ru)10 μl（20 μg）EGFP質粒 (植物用綠色熒光蛋白)，加(jia)(jia)入(ru)100 μl制備(bei)好的原(yuan)(yuan)生質體(ti)，輕柔(rou)混(hun)勻(yun)后(hou)加(jia)(jia)入(ru)110 μl當日(ri)配制好的轉(zhuan)化(hua)試(shi)劑溶液(ye)(ye)，輕柔(rou)混(hun)勻(yun)，常溫(wen)靜置(zhi)5 min后(hou)加(jia)(jia)入(ru)440 μl溶液(ye)(ye)II終止轉(zhuan)化(hua)，輕輕顛倒混(hun)勻(yun)，常溫(wen)100 g離心(xin)1 min，去除(chu)上清(qing)，再加(jia)(jia)入(ru)0.5 ml溶液(ye)(ye)II，輕柔(rou)重懸原(yuan)(yuan)生質體(ti)，常溫(wen)100 g離心(xin)1 min后(hou)，盡量去除(chu)上清(qing)，收集原(yuan)(yuan)生質體(ti)。加(jia)(jia)入(ru)1 ml溶液(ye)(ye)V，小(xiao)心(xin)重懸原(yuan)(yuan)生質體(ti)后(hou)水平放置(zhi)25℃培養過夜(約16h)，次日(ri)于熒光顯微鏡(jing)下檢(jian)測EGFP熒光信號。

四、 產品發表文章：

1 TaEXPB7-B,a-expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.

Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu. 

J Plant Physiology 2019 //doi.org/10.1016/j.jplph.2019.153004

2 Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X infection.

Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,  Jianping Chen，Fei Yan.

Journal of Experimental Botany, 2020，71（6）2142–2156, doi:10.1093/jxb/erz565

植物原生質體提取試劑盒發表文章列表（15篇）

1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a -expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.

實驗植物：小麥

Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu.

Journal: J Plant Physiology 2019

Institution：  College of Life Sciences, Northeast Agricultural University

Paper link：

2. [IF=5.36] Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X infection. 

實驗植物：煙草

Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,  Jianping Chen and Fei Yan

Journal: Journal of Experimental Botany, 2020，Vol.71, No. 6,2142–2156, 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：

3. [IF=7.228]  Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection

實驗植物：煙草

Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu, Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng, Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan

Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30 July 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：

4. [IF=5.64]  A Novel, Small Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger Plant Cell Death

實驗植物：水稻

Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin, Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng

Journal: Fronties in Microbiology August 2021 | Volume 12 | Article 684923 

Institution：Sichuan Agricultural University

Paper link：

5. [IF=9.8]  Synthesis of flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in DNA methylation during peach fruit ripening

實驗植物：煙草

Author: Chunyan Wei, Hongru Liu, Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang

Journal: Plant Biotechnology Journal (2021) 19, pp. 2082–2096 

Institution：Laboratory of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University

Paper link：

6. [2020IF=1.04]  EoPHR2, a Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides

實驗植物：擬南芥

Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2, Shenghao Zhou3, Haoran Wang

Journal: Phyton Vol.91, No.3, 2022, pp.651-665

Institution： Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences

Paper link：

7. [2021IF=3.2]  Establishment and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus pluvia

實驗材料：雨生紅球藻 Haematococcus pluvia

Author: Chunli Guo，Muhammad Anwar， Rui Mei，Xinyi Li， Di Zhao，Yanan Jiang， Jieyi Zhuang， Chen Liu，Chaogang Wang， Zhangli Hu

Journal: Journal of Applied Phycology. Published online 07 March 2022

Institution：College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University

Paper link： 

8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in Nelumbo nucifera Gaertn

實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn

Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang, Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding

Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.

Institution：College of Life Sciences, Guizhou University，College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link： //www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901

9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association analysis reveals a novel pathway mediated by a dual-TIR domainprotein for pathogen resistance in cotton

實驗材料：棉花

Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang, Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang

Journal: Genome Biology  (2023) 24:111

Institution：Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences

Paper link： //doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9

10. [2022 IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L

實驗材料：Rose 玫瑰

Author: Chen Yeqing ,Lu  Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo ,Yuan Guozhen ,Sun  Jingjing ,Liu  Jinyi ,Wang Changquan

Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link： 

11. [2022 IF=17.4] Functionalized carbon nano-enabled plant ROS signal engineering for growth / defense balance

實驗材料：擬南芥

Author: Zhijiang Guo , Qiong Chen , Taibo Liang , Baoyuan Zhou , Suhua Huang , Xiufeng Cao, Xiuli Wang , Zaisong Ding, Jiangping Tu

Journal: Nano Today 53 (2023) 102045

Institution：School of Materials Science and Engineering, Zhejiang University

Paper link：

12. [2022 IF=13.8] Unveiling the mechanism of broad-spectrum blast resistance in rice: The collaborative role of transcription factor OsGRAS30 and histone deacetylase OsHDAC1

實驗材料：水稻

Author: Jiaqi Hou, Huangzhuo Xiao, Peng Yao, Xiaoci Ma, Qipeng Shi, Jin Yang, Haoli Hou and Lijia Li

Journal: Plant Biotechnology Journal (2024), pp. 1–17

Institution：State Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link：

13. [2022 IF=7.2] NnSnRK1-NnATG1-mediated autophagic cell death governs flower bud abortion in shaded lotus

實驗材料：荷花

Author: Xiehongsheng Li, Yingchun Xu, Zongyao Wei, Jiaying Kuang, Mingzhao She, Yanjie Wang and Qijiang Jin

Journal: Plant J (2024) 117, 979–998

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link：

14. [2022 IF=7.5] The dynamic TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90 complex modulates NLR-protein-mediated antiviral immunity in wheat.

實驗材料：小麥

Author: Haichao Hu, Tianye Zhang, Jinnan Wang, Jun Guo, Yaoyao Jiang, Qiansheng Liao, Lu Chen, Qisen Lu,Peng Liu, Kaili Zhong, Jiaqian Liu, Jianping Chen, Jian Yang

Journal: Cell Reports 43, 114765, October 22, 2024

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University

Paper link：

15. [2023 IF=14.3] Natural SNP Variation in GbOSM1 Promotor Enhances Verticillium Wilt Resistance in Cotton.

實驗材料：棉花

Author: Guilin Wang, Dayong Zhang, Haitang Wang, Jinmin Kong, Zhiguo Chen, Chaofeng Ruan, Chaoyang Deng, Qihang Zheng, Zhan Guo, Hanqiao Liu, Weixi Li, Xinyu Wang,and Wangzhen Guo

Journal: Advanced Science 2024, 2406522

Institution：Nanjing Agricultural University

Paper link：