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植物原生質體轉化試劑盒                                      

●  產品組成：

● 產品簡介：

植物原生質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。植物原生質體轉化試劑盒(Plant Protoplasts Transformation Kit)采用的是聚乙二醇轉化方法，借助聚乙二醇短時間內對原生質體產生的沖擊效應，使質粒DNA、RNA或蛋白得以進入原生質體，經轉化的植物原生質體經過一定時間培養后，可用于檢測外源基因的表達和功能，轉化后基因敲除或基因編輯效果等。

對于擬南芥原生質體，使用本試劑盒轉化質粒后通常2-6小時可以檢測相關基因的轉錄變化(mRNA等RNA的變化)，通常2-16小時后可以檢測到相關蛋白表達的變化，通常24小時可以檢測到基因編輯的效果。

本試劑盒可以用(yong)于(yu)相當于(yu)6孔(kong)(kong)板40個(ge)孔(kong)(kong)的(de)樣(yang)品，12孔(kong)(kong)板20個(ge)孔(kong)(kong)的(de)樣(yang)品，或24孔(kong)(kong)板40個(ge)孔(kong)(kong)的(de)樣(yang)品的(de)轉化。

本試(shi)劑盒(he)不含(han)有(you)原(yuan)生質(zhi)體制備(bei)試(shi)劑，需要制備(bei)原(yuan)生質(zhi)體請參見植物(wu)原(yuan)生質(zhi)體制備(bei)試(shi)劑盒(he)（RTU4082 ）。

● 貯存和效期：

   按(an)照溫(wen)度貯存，有效期一年。轉化試劑現用現配。

試劑(ji)盒常溫運(yun)輸(shu)。

● 使用說明：

   需要準備的材料（試劑盒不提供）：

   平頭鑷子；一次性刀片；50ml離心(xin)(xin)管；1.5ml離心(xin)(xin)管；水浴鍋

 一、原生質體轉化步驟：

1. 轉化溶液配制：

植(zhi)物原(yuan)生質(zhi)體轉(zhuan)(zhuan)化參(can)考下表(biao)根據(ju)樣品(pin)量(liang)配制轉(zhuan)(zhuan)化溶液。

轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時配制，以確保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制后盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之內仍然有較好(hao)的轉化(hua)(hua)效(xiao)率(lv)，但和當天配(pei)制的轉化(hua)(hua)溶液相比，轉化(hua)(hua)效(xiao)果可(ke)能會有一定(ding)程度的下(xia)降(jiang)。

2. 準備質粒：

取10 μl質粒DNA(10-20 μg，濃(nong)度(du)為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心(xin)管中。

注：質(zhi)(zhi)粒(li)大(da)小(xiao)建(jian)議為(wei)5-10 kb，質(zhi)(zhi)粒(li)濃度(du)(du)為(wei)1-2 μg/μl左右；原生(sheng)(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)轉(zhuan)化(hua)(hua)對于(yu)(yu)質(zhi)(zhi)粒(li)的(de)純(chun)(chun)度(du)(du)要(yao)求較(jiao)高，盡量使(shi)用高純(chun)(chun)度(du)(du)的(de)質(zhi)(zhi)粒(li)。多個質(zhi)(zhi)粒(li)同時(shi)轉(zhuan)化(hua)(hua)時(shi)的(de)體(ti)積和總質(zhi)(zhi)量保(bao)持不(bu)變。多個質(zhi)(zhi)粒(li)轉(zhuan)化(hua)(hua)時(shi)，每種質(zhi)(zhi)粒(li)的(de)用量比(bi)例(li)，需(xu)要(yao)酌情自行(xing)(xing)調整(zheng)。質(zhi)(zhi)粒(li)轉(zhuan)化(hua)(hua)也(ye)可以(yi)在(zai)12或24孔(kong)板中(zhong)(zhong)進行(xing)(xing)，轉(zhuan)化(hua)(hua)體(ti)系也(ye)可以(yi)按照比(bi)例(li)放大(da)或縮小(xiao)。本試(shi)劑盒中(zhong)(zhong)描述(shu)的(de)用量相(xiang)當(dang)于(yu)(yu)是6孔(kong)板中(zhong)(zhong)的(de)用量。原生(sheng)(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)用多孔(kong)板培養時(shi)，最(zui)好(hao)選(xuan)擇未經(jing)表面(mian)(mian)處理的(de)多孔(kong)板。對于(yu)(yu)經(jing)過表面(mian)(mian)處理的(de)動(dong)物細胞培養用多孔(kong)板，可以(yi)使(shi)用5%胎牛血(xue)清或小(xiao)牛血(xue)清處理孔(kong)表面(mian)(mian)數秒，這樣有助于(yu)(yu)減小(xiao)孔(kong)底表面(mian)(mian)對于(yu)(yu)原生(sheng)(sheng)質(zhi)(zhi)體(ti)的(de)損(sun)傷。

3. 質粒轉化：

3.1 質粒管中加入100 μl原生質體溶液（原生質體密度為2×10⁵/ml，約2萬個原(yuan)生質(zhi)體），輕柔混勻。

3.2 加入(ru)等體積即(ji)110 μl 步驟1事先準備好的(de)轉化溶液，輕彈管底，輕柔(rou)混勻，常溫25℃放置5-15分鐘。

注：最長可以孵育15 min，但通(tong)常孵育5min時間(jian)已經足夠。最佳(jia)的(de)孵育時間(jian)對于不(bu)同的(de)原生(sheng)質體和(he)不(bu)同的(de)質粒需要通(tong)過實驗摸索。

4. 終止轉化：

加入2倍體積轉化(hua)終(zhong)止溶液即440 μl，輕(qing)柔徹底混勻，終(zhong)止轉化(hua)過程(cheng)。

5. 收集原生質體：

常溫100g離心1-2分鐘，盡量去除上清。

注(zhu)：由于轉化后的(de)溶(rong)液(ye)會非常粘稠，加入轉化終止溶(rong)液(ye)后離(li)心(xin)(xin)1 min通常可(ke)以使原(yuan)生(sheng)(sheng)質(zhi)(zhi)體聚集在管底，但使用某些突變體時(shi)為減(jian)少原(yuan)生(sheng)(sheng)質(zhi)(zhi)體損失，可(ke)將離(li)心(xin)(xin)時(shi)間延長到2 min。為了避免原(yuan)生(sheng)(sheng)質(zhi)(zhi)體離(li)心(xin)(xin)時(shi)貼在管壁，建議(yi)整個實驗過程使用水平轉頭；離(li)心(xin)(xin)時(shi)，可(ke)調低離(li)心(xin)(xin)機(ji)的(de)升(sheng)速(su)(su)和(he)降速(su)(su)。升(sheng)速(su)(su)過快，原(yuan)生(sheng)(sheng)質(zhi)(zhi)體可(ke)能離(li)到管壁上；降速(su)(su)過快，可(ke)能導致管底原(yuan)生(sheng)(sheng)質(zhi)(zhi)體懸起。建議(yi)升(sheng)速(su)(su)和(he)降速(su)(su)分別都使用3。

6. 原生質體漂洗：

   加入(ru)500 μl 轉化終止(zhi)溶液輕輕重懸原生(sheng)質體，常(chang)溫100g離心(xin)1 min，盡(jin)量去除(chu)殘留的上清。

注：本(ben)步驟可以充分去(qu)除(chu)殘留的(de)轉化(hua)試劑(ji)溶液中的(de)組分，避免轉化(hua)試劑(ji)溶液中的(de)組分對于后(hou)續(xu)的(de)不良影響。

7. 原生質體重懸：

沉淀中加入1 ml培養溶(rong)液，輕柔(rou)重懸。

8. 原生質體培養：

將離心(xin)管水平(ping)放置，23-25oC弱光(guang)培養。

注：根(gen)據(ju)實(shi)驗需求(qiu)確(que)定孵育(yu)時(shi)間。RNA分(fen)(fen)析孵育(yu)2-6小時(shi)；酶活性分(fen)(fen)析和蛋白標(biao)記(ji)實(shi)驗孵育(yu)2-16小時(shi)；基因編輯的效果在轉化24小時(shi)后(hou)可能被檢(jian)測到(dao)。

                                   使用植(zhi)物原生質(zhi)體轉(zhuan)化(hua)試(shi)劑盒(he)轉(zhuan)化(hua)擬南芥原生質(zhi)體的效果圖。

實(shi)驗步(bu)驟：稱取0.48 g轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化試劑于(yu)2 ml 離(li)(li)(li)心(xin)(xin)管中(zhong)，加(jia)(jia)入轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化試劑溶(rong)解(jie)液后(hou)，顛(dian)(dian)倒混勻(yun)，蒸餾水定容(rong)至2 ml，使轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化試劑充分溶(rong)解(jie)后(hou)備(bei)用(yong)。在2 ml的圓底離(li)(li)(li)心(xin)(xin)管中(zhong)加(jia)(jia)入10 μl（20 μg）EGFP質粒 (植物用(yong)綠色熒(ying)(ying)光(guang)蛋白)，加(jia)(jia)入100 μl制(zhi)備(bei)好的原(yuan)生質體(ti)，輕(qing)(qing)柔混勻(yun)后(hou)加(jia)(jia)入110 μl當日配制(zhi)好的轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化試劑溶(rong)液，輕(qing)(qing)柔混勻(yun)，常溫靜置5 min后(hou)加(jia)(jia)入440 μl轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化終(zhong)(zhong)止溶(rong)液終(zhong)(zhong)止轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)顛(dian)(dian)倒混勻(yun)，常溫100 g離(li)(li)(li)心(xin)(xin)1 min，去除上清，再加(jia)(jia)入0.5 ml 轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)(zhuan)化終(zhong)(zhong)止溶(rong)液，輕(qing)(qing)柔重(zhong)懸原(yuan)生質體(ti)，常溫100 g離(li)(li)(li)心(xin)(xin)1 min后(hou)，盡量去除上清，收集原(yuan)生質體(ti)。加(jia)(jia)入1 ml培養溶(rong)液，小(xiao)心(xin)(xin)重(zhong)懸原(yuan)生質體(ti)后(hou)水平(ping)放置25℃培養過夜(ye)(約16h)，次日于(yu)熒(ying)(ying)光(guang)顯微鏡下檢測EGFP熒(ying)(ying)光(guang)信(xin)號。

植物原生質體提取試劑盒發表文章列表

1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a -expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.

實驗植物：小麥

Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu.

Journal: J Plant Physiology 2019

Institution：  College of Life Sciences, Northeast Agricultural University

Paper link：

2. [IF=5.36] Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X infection. 

實驗植物：煙草

Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,  Jianping Chen and Fei Yan

Journal: Journal of Experimental Botany, 2020，Vol.71, No. 6,2142–2156, 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：

3. [IF=7.228]  Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection

實驗植物：煙草

Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu, Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng, Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan

Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30 July 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：

4. [IF=5.64]  A Novel, Small Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger Plant Cell Death

實驗植物：水稻

Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin, Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng

Journal: Fronties in Microbiology August 2021 | Volume 12 | Article 684923 

Institution：Sichuan Agricultural University

Paper link：

5. [IF=9.8]  Synthesis of flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in DNA methylation during peach fruit ripening

實驗植物：煙草

Author: Chunyan Wei, Hongru Liu, Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang

Journal: Plant Biotechnology Journal (2021) 19, pp. 2082–2096 

Institution：Laboratory of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University

Paper link：

6. [2020IF=1.04]  EoPHR2, a Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides

實驗植物：擬南芥

Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2, Shenghao Zhou3, Haoran Wang

Journal: Phyton Vol.91, No.3, 2022, pp.651-665

Institution： Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences

Paper link：

7. [2021IF=3.2]  Establishment and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus pluvia

實驗材料：雨生紅球藻 Haematococcus pluvia

Author: Chunli Guo，Muhammad Anwar， Rui Mei，Xinyi Li， Di Zhao，Yanan Jiang， Jieyi Zhuang， Chen Liu，Chaogang Wang， Zhangli Hu

Journal: Journal of Applied Phycology. Published online 07 March 2022

Institution：College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University

Paper link： 

8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in Nelumbo nucifera Gaertn

實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn

Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang, Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding

Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.

Institution：College of Life Sciences, Guizhou University，College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link： //www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901

9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association analysis reveals a novel pathway mediated by a dual-TIR domainprotein for pathogen resistance in cotton

實驗材料：棉花

Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang, Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang

Journal: Genome Biology  (2023) 24:111

Institution：Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences

Paper link： //doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9

10. [2022 IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L

實驗材料：Rose 玫瑰

Author: Chen Yeqing ,Lu  Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo ,Yuan Guozhen ,Sun  Jingjing ,Liu  Jinyi ,Wang Changquan

Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link：