植(zhi)物葉綠體提取(qu)試劑盒
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產品編號
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產品(pin)名稱(cheng)
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包裝
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RTU5001
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植物葉(xie)綠體提取試(shi)劑盒(he)
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10次
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● 產品簡介：
葉(xie)綠(lv)體(ti)（Chloroplast）是的一種, 是和一(yi)些所特有的轉換器，是光合作用的反應(ying)場(chang)所。在高等(deng)(deng)植物中葉綠體為雙(shuang)凸或平凸透鏡，長(chang)徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高等(deng)(deng)植物的一般含50～200個葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)，可占細胞(bao)質的40%，葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)的數目因物(wu)種(zhong)(zhong)細胞(bao)類型，生態環境，生理狀態而有所不(bu)同(tong)。葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)由葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)外被(bei)(chloroplast envelope)、類囊體(ti)(ti)(thylakoid)和基(ji)質(stroma)三部分(fen)(fen)組成(cheng)，含有3種(zhong)(zhong)不(bu)同(tong)的膜：外膜、內膜、類囊體(ti)(ti)膜和3種(zhong)(zhong)彼(bi)此(ci)分(fen)(fen)開的腔(qiang)：膜間隙、基(ji)質和類囊體(ti)(ti)腔(qiang)。本公司的植物(wu)葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)提取(qu)試劑(ji)盒(he)采(cai)用密度梯度離心方法，可以從多種(zhong)(zhong)植物(wu)中提取(qu)高(gao)純度的葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)。
1.
即用型試劑盒，用戶不需(xu)要單獨配制(zhi)各種(zhong)溶液。
2.
試劑盒可以用(yong)(yong)于(yu)葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)粗提，所得葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)含少量其他細胞器污染(ran)，可用(yong)(yong)于(yu)后續的(de)SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白(bai)組分(fen)析。也可以用(yong)(yong)于(yu)葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)精提，所得葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)完整，可用(yong)(yong)于(yu)后續的(de)光合(he)作(zuo)用(yong)(yong)，電子鏈(lian)和磷酸化，跨膜轉(zhuan)運，體(ti)(ti)外(wai)葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)蛋白(bai)合(he)成，蛋白(bai)定位(wei)等研究。還可用(yong)(yong)于(yu)葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)膜，基(ji)質，類囊體(ti)(ti)的(de)提取以及葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)DNA和葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)(ti)RNA純化。
3.
以每次處理30
g葉(xie)片計算，本產品可(ke)使用(yong)8-10次提(ti)取，每次能得到3-5
mg左右葉(xie)綠體(ti)。
4.
已(yi)經成功用于擬南芥，綠蘿，菠菜(cai)，大(da)豆，萵(wo)筍，白菜(cai)，煙(yan)草和甜(tian)菜(cai)等植物，還(huan)可用于更多植物（可能(neng)需要優化條(tiao)件(jian)）。
● 貯存及運輸：
4-8℃保存，至少一年有效；試劑盒常溫運輸。
● 產品組成：
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產品貨號
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產品名稱
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包(bao)裝
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貯存
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RTU5001-01
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葉綠體(ti)提取緩(huan)沖液（5×）
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2×250
ml
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4-8℃
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RTU5001-02
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密度梯度分離試劑
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65
ml
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4-8℃
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RTU5001-03
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BSA
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3
g
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4-8℃
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RTU5001-04
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1
M DTT（粉末裝）
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2.5
ml
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4-8℃
配制后(hou)-20℃貯存
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RTU5001-05
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過濾(lv)紙(zhi)
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50張(zhang)/包
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RT
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說明書(shu)
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一份(fen)
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-
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● 使用說明：
注意：葉綠體(ti)(ti)對溫(wen)度(du)(du)高度(du)(du)敏感，所(suo)以整個操(cao)作必須(xu)在冰(bing)上或者在冷(leng)室(shi)進行(xing)，所(suo)用器皿和溶液均需要(yao)在4℃預(yu)冷(leng)。離心時一定要(yao)在4℃進行(xing)，離心力以g而不是rpm計算。如果需要(yao)研究葉綠體(ti)(ti)的功能(neng)，提取過程還(huan)需要(yao)在昏暗的光線條件(jian)下進行(xing)。
需要(yao)自備材料：
剪刀(dao)；50
ml尖底(di)或(huo)圓底(di)離(li)心管；15
ml尖底(di)或(huo)圓底(di)離(li)心管；漏斗；勻漿機；低溫離(li)心機。
1.1 材(cai)料(liao)預處理：
實驗前(qian)1-2天將植(zhi)物放在(zai)暗室培養以減少葉綠體中淀(dian)粉(fen)顆(ke)粒的形成，否則離心時這(zhe)些(xie)顆(ke)粒很容易使(shi)葉綠體破(po)裂。葉片在(zai)實驗前(qian)需先用自來水洗(xi)凈，再用蒸餾水淋洗(xi)，去掉(diao)多余水分。如果葉片采(cai)集(ji)后(hou)不能立即處理(li)，則保存時需要保持葉片濕潤(run)，即使(shi)如此，葉片采(cai)集(ji)后(hou)的放置時間也不能超過(guo)一天。
1.2
1×葉(xie)綠體提取緩沖液（即用型）配制(zhi)：
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1×葉綠體提取緩沖(chong)液(ye)（即用型）
配制量200 ml
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葉綠體提取緩(huan)沖(chong)液(ye)（5×）
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40 ml
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BSA
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0.2 g
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1 M DTT
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200 μl
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滅菌水
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定容至200 ml
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冰(bing)上(shang)預冷(leng)待用(yong)，現(xian)用(yong)現(xian)配，不建(jian)議貯(zhu)存(cun)
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注(zhu)：一(yi)個30克(ke)樣品提取反(fan)應需要 150 ml 1×葉綠(lv)體提取緩沖液（即用型）。
1.3 葉片(pian)勻漿：
1.3.1 新(xin)鮮采集植物葉片(pian)，快速去除葉脈（約(yue)30克）并將葉(xie)片剪成1-3 cm2大小的(de)碎片并浸泡在150 ml的預冷的1×葉綠體(ti)提取緩沖液(ye)（即用型）中(zhong)（每克葉片加5 ml）。
1.3.2 將(jiang)浸泡了葉片的溶液轉移到勻漿(jiang)機（貨號(hao)：RT-2243A）中，低速勻漿10秒，避免起(qi)泡沫(mo)。用玻(bo)璃(li)棒把液面的碎片按(an)入勻漿機底部(bu)后，再低速勻漿10秒，重復10秒勻漿3-4次至葉片破碎即可，不要過分勻漿，否(fou)則會(hui)降(jiang)低完(wan)整(zheng)葉綠體的得率。
1.3.3 用2層過濾(lv)紙(zhi)置于小漏斗上，將勻漿(jiang)液過濾(lv)收集到預冷的(de)250 ml量筒中，一般更(geng)換(huan)三次濾紙可收集約120 ml濾液，將濾液等分到4個預(yu)冷的(de)50 ml的(de)塑料離心管中（每(mei)個管中的(de)濾液不要超過35 ml）。
1.4 離心去雜質：
4℃ 200 g離心5分鐘，沉淀為(wei)未破裂植物組(zu)織、細胞(bao)或細胞(bao)核，如果(guo)樣品中淀粉含量較高(gao)，沉淀可能為(wei)白色。（右圖）
注(zhu)：此步驟用低(di)速離心去除(chu)雜(za)質，不能省略，否(fou)則提取的葉(xie)綠體會有其他細(xi)胞器的污染。
1.5 收集葉綠(lv)體粗提(ti)液：
1.5.1將步驟1.4得到的上清液平分到4個(ge)預冷(leng)的50 ml塑料離(li)心管中。
1.5.2 4℃ 1100 g離心15分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體，呈(cheng)深綠色（右圖）。
1.5.3 在沉淀中加入1.5 ml 預(yu)冷的1×葉綠體提(ti)取緩沖液（即(ji)用型），手彈(dan)離心(xin)管(guan)底部使葉綠體重懸，收集4管(guan)溶液（約6 ml），此(ci)溶(rong)液即為葉(xie)綠體(ti)粗提產(chan)物（含有破碎(sui)的(de)(de)葉(xie)綠體(ti)和完整的(de)(de)葉(xie)綠體(ti)），可直接用于(yu)后續(xu)的(de)(de)SDS-PAGE，Western，蛋白組分析。
注：重懸時最(zui)好避免溶液起泡，手指輕(qing)彈，不要用槍頭吹打，否則葉(xie)綠體容易破裂。
1.6 完(wan)整葉綠體的純化：
葉綠(lv)體重懸液配制
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葉綠體重懸(xuan)液
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配制量20 ml
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葉(xie)綠體(ti)提取緩(huan)沖(chong)液（5×）
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4 ml
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滅菌水
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16 ml
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冰上預冷待用(yong)，現(xian)用(yong)現(xian)配，不(bu)建(jian)議貯存(cun)
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1.6.1 單梯(ti)度(du)分離法（適合菠菜(cai)，白(bai)菜(cai)，萵苣，擬南芥，綠蘿等(deng)）：
1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml：
在15 ml離心管中加入(ru)6 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和(he)4 ml密度梯(ti)度分(fen)離試劑(ji)，充分(fen)混合均勻，得40%密度梯度液(ye)，冰(bing)浴備(bei)用。
1.6.1.2將10 ml 40%密度梯度液平(ping)分(fen)到2個 15 ml離心管(guan)中，每管(guan)5 ml；將步驟1.5.3得到的(de)葉綠(lv)體粗提液3 ml小心鋪在5 ml密度(du)梯度(du)液之上；另一(yi)管重復。（5 ml 40%密度梯度液用可以(yi)分離3 ml 葉綠(lv)體粗(cu)提(ti)液，其他體積以此比例換算）。
1.6.1.3 4℃ 3200 g離心(xin)15分鐘，綠色沉淀為完整葉綠體(ti)（右圖）。
注(zhu)：如果最上(shang)層的(de)分(fen)離(li)試劑不夠(gou)清亮，可以延長離(li)心20分鐘。
1.6.1.4 小(xiao)心棄上清，保留(liu)沉淀，每管沉淀中加入(ru)1 ml 葉綠(lv)體重懸液，輕(qing)柔(rou)重懸，可(ke)以收集(ji)到2 ml完(wan)整葉綠(lv)體溶液。
1.6.2雙梯度(du)分離法(fa)（適合煙草，甜菜，豌豆等）：
1.6.2.1 80%密(mi)度梯度重液配制-4 ml：
在15 ml離心管中加入(ru)0.8 ml 1×葉綠體提取(qu)緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離(li)試劑，充分混(hun)合均勻，得80%密度梯(ti)度重(zhong)液。
1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制(zhi)-8 ml：
在另(ling)一15 ml離心管加(jia)入4.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液(ye)（即用型）和3.2 ml 密(mi)度梯度分離(li)試(shi)劑，充分混(hun)合均勻，得40%密度梯度輕液(ye)。
1.6.2.3 取一(yi)只15 ml離心管(guan)，加入1.86 ml 80%密度梯(ti)度重液(ye)，隨后取(qu)3.74 ml 40%密度梯度輕液小心鋪在80%密度(du)梯(ti)度(du)重液之上，冰浴備用；然后取步驟1.5.3得到的3 ml葉綠(lv)體粗提液小心鋪在密度梯(ti)度輕(qing)液之上。另一管重復(fu)。
注：每5.6 ml
40%/80%密(mi)度梯度液(ye)可以(yi)分離(li)3 ml 葉(xie)綠體粗提液；其他體積按照比(bi)例調整。
1.6.2.4 4℃ 3200 g離心15分鐘(zhong)，上層綠色(se)帶(dai)含破碎的葉(xie)綠體(ti)、線粒體(ti)和(he)核糖體(ti)等，重(zhong)液(ye)和(he)輕液(ye)間的綠色(se)帶(dai)為完整葉(xie)綠體(ti)（右(you)圖）。
注：如果(guo)最上層的分(fen)離試劑不夠清亮，可以(yi)延長離心20分鐘。
1.6.2.5 重懸葉綠體：
用廣口吸管小(xiao)心將(jiang)重液和輕液之間(jian)的綠(lv)色帶(dai)（完整(zheng)葉綠(lv)體(ti)）轉移(yi)到新的15 ml離心管中，加入三(san)倍體積預冷的葉綠體重懸液，輕柔混勻。
1.6.2.6 離心收集葉綠(lv)體：
4℃ 1750 g離心6分鐘，小心(xin)將上(shang)清倒出后，在綠(lv)色的葉綠(lv)體(ti)沉淀中加入預冷的0.5 ml葉綠體(ti)(ti)重懸(xuan)液，手指(zhi)輕彈(dan)管底使葉綠體(ti)(ti)重懸(xuan)。最終可以收(shou)集(ji)到1
ml完整葉(xie)綠體溶(rong)液。
1.7 葉(xie)綠體貯(zhu)存：
葉綠(lv)體可在顯微(wei)鏡下檢查葉綠(lv)體完整性(xing)。葉綠(lv)體重懸液避(bi)光-80℃保存。葉(xie)綠體(ti)(ti)必須盡(jin)快使用(yong)，否則非常容(rong)易失(shi)去活性(xing)。所(suo)得精提(ti)葉(xie)綠體(ti)(ti)可用(yong)于后續(xu)的光合(he)作用(yong)，電子鏈(lian)和磷酸化，跨膜轉運(yun)，體(ti)(ti)外葉(xie)綠體(ti)(ti)蛋白合(he)成，蛋白定位(wei)等研究。還可用(yong)于葉(xie)綠體(ti)(ti)膜，基質，類囊體(ti)(ti)提(ti)取(qu)以及葉(xie)綠體(ti)(ti)DNA和(he)葉綠體RNA純(chun)化實驗等。
1.8 葉綠素含(han)量測定：
通(tong)常葉(xie)(xie)(xie)綠體(ti)(ti)含(han)量(liang)用單位葉(xie)(xie)(xie)綠素含(han)量(liang)來表(biao)示，即x
mg 葉(xie)(xie)(xie)綠素/ml 葉(xie)(xie)(xie)綠體(ti)(ti)懸(xuan)浮液。
1.8.1
取10 μl 葉綠體(ti)懸浮(fu)液(ye)(ye)加入(ru)到990
μl 80%丙酮溶液(ye)(ye)中，混勻。
1.8.2
3000 g 離心(xin)5分鐘，取上清測定OD652 吸光值，用(yong)80%丙(bing)酮(tong)做空白(bai)對照。
1.8.3
根據以下公式計算葉綠素(su)：
葉綠素(su)濃度（mg/ml）=（OD652×100）/36
100：稀釋倍(bei)數
36：extinction
coefficient in ml/cm·mg
1.9 實驗示例：
30克(ke)綠(lv)(lv)(lv)蘿(luo)葉(xie)片(pian)，加(jia)入(ru)150
ml 1×葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)體提(ti)取緩沖(chong)液（即用(yong)型(xing)）勻漿5×10秒，3次過濾(lv)共(gong)收集120
ml過濾(lv)液，平分4管(guan)，4℃ 1100
g 離心15 min，棄上清，每管(guan)重懸于1.5
ml 1×葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)體提(ti)取緩沖(chong)液（即用(yong)型(xing)）中，共(gong)得(de)到6
ml 葉(xie)綠(lv)(lv)(lv)體粗提(ti)液。2×3
ml 粗提(ti)液平鋪于2×5
ml 40%密度梯度液之上，4℃ 3200 g離心15分鐘，棄(qi)上(shang)清(qing)，每管沉淀重(zhong)懸于1 ml 葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)重(zhong)懸液中，共得到2 ml精制(zhi)葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)重(zhong)懸液，測定(ding)葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)(lv)素含量為(wei)3.43 mg/ml重(zhong)懸液。30克葉(xie)(xie)(xie)片(pian)提取得到6.86 mg葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)。取10
μl葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)(lv)體(ti)溶(rong)液稀釋20倍，取50 μl稀釋液顯微鏡(jing)40倍物鏡(jing)觀察，如右圖(tu)。
