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植物類囊體膜提取試劑盒         Ver.731075

● 產品簡介：

葉綠體（Chloroplast）是的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的轉換器，是光合作用的反應場所。在高等植物中葉綠體象雙凸或平凸透鏡，長徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的一般含50～200個葉(xie)綠(lv)體，可占細胞(bao)質(zhi)的(de)(de)40%，葉(xie)綠(lv)體的(de)(de)數(shu)目因物種細胞(bao)類(lei)型，生(sheng)態環境，生(sheng)理狀態而有所不同(tong)。葉(xie)綠(lv)體由葉(xie)綠(lv)體被膜(mo)(mo)(chloroplast envelope)、類(lei)囊(nang)體(thylakoid)和(he)(he)基質(zhi)(stroma)三部(bu)分(fen)組成，含有3種不同(tong)的(de)(de)膜(mo)(mo)：外膜(mo)(mo)、內(nei)膜(mo)(mo)、類(lei)囊(nang)體膜(mo)(mo)和(he)(he)3種彼此(ci)(ci)分(fen)開的(de)(de)腔(qiang)：膜(mo)(mo)間隙(xi)、基質(zhi)和(he)(he)類(lei)囊(nang)體腔(qiang)。類(lei)囊(nang)體膜(mo)(mo)上(shang)含有光合(he)色素和(he)(he)電子傳遞鏈組分(fen)，光反應在此(ci)(ci)上(shang)進行，因此(ci)(ci)類(lei)囊(nang)體膜(mo)(mo)也稱(cheng)光合(he)膜(mo)(mo)。

本(ben)公司(si)的植物類囊體(ti)膜提取(qu)試劑盒采用差速離心方(fang)法，可以(yi)從植物中提取(qu)到高純(chun)度的類囊體(ti)膜樣品。

1. 即(ji)用(yong)型試劑盒，用(yong)戶不需要單(dan)獨配制各(ge)種溶液。

2. 每次處理30 g葉(xie)片計算，本(ben)產品可使用8-10次提取，每次能得到8-10 mg左右(you)類囊體膜樣品。

3. 已經成功用(yong)于擬(ni)南(nan)芥，綠蘿，菠菜，豌豆，煙草等植(zhi)物(wu)，還可(ke)用(yong)于更(geng)多植(zhi)物(wu)（可(ke)能需要優化條件）。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存(cun)，至少一年有(you)效；試劑(ji)盒常溫運輸。

● 產品組成：

● 使用說明：

注意(yi)：類囊體膜對溫度高度敏感，所(suo)以整(zheng)個(ge)操(cao)作必須在冰上或(huo)者在冷室進行，所(suo)用器皿和

溶(rong)液(ye)均需(xu)要(yao)在(zai)4℃預冷。離(li)心時一定要(yao)在(zai)4℃進(jin)行(xing)，離(li)心力以(yi)g而不是rpm計算(suan)。如果需(xu)要(yao)研究類囊體(ti)膜(mo)的功能，提取過(guo)程(cheng)還需(xu)要(yao)在(zai)昏暗的光(guang)線條件下(xia)進(jin)行(xing)。

需要自備材料：

剪(jian)刀；50 ml尖底或(huo)圓底離心管；15 ml尖底或(huo)圓底離心管；勻(yun)漿機；低溫離心機。

1.1 材料預處理：

 葉(xie)(xie)片(pian)在實驗前(qian)需先(xian)用自來(lai)水洗凈，再用蒸餾(liu)水淋洗，去掉多余水分。如果葉(xie)(xie)片(pian)采集后不能(neng)立即處(chu)理，則保存時(shi)需要(yao)保持葉(xie)(xie)片(pian)濕(shi)潤(run)，即使如此(ci)，葉(xie)(xie)片(pian)采集后的放置時(shi)間也不能(neng)超過(guo)一天。

1.2  1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）配制：

注：一個30克樣品提取反應需要 120 ml 1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物葉片（約30克），快速去除葉脈并將葉片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在120 ml的預冷的1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加4 ml）。

1.3.2 將浸泡了葉片的溶液轉移到電動勻漿機（即家用制備果汁的勻漿機，可選貨號：RT-2243A）中，低速勻漿5秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機底部后，再低速勻漿5秒(miao)。注意：除電動勻(yun)(yun)漿(jiang)(jiang)機外(wai)，還可(ke)(ke)以選(xuan)擇玻璃勻(yun)(yun)漿(jiang)(jiang)器和研磨(mo)（加(jia)玻璃珠(zhu)）等裂解細(xi)胞的方法(fa)，但(dan)這(zhe)些方法(fa)的單(dan)次處(chu)理量都比(bi)較小，需要將樣(yang)品分成(cheng)很多小份單(dan)獨勻(yun)(yun)漿(jiang)(jiang)，然后再匯集(ji)。注：不要用液氮研磨(mo)，會損傷類囊體(ti)膜(mo)；不要過度勻(yun)(yun)漿(jiang)(jiang)，把葉片打碎即可(ke)(ke)，否則會降低類囊體(ti)膜(mo)得(de)率。

1.3.3過濾勻漿液：2層過濾紙放于漏斗上，用漏斗將濾液收集到預冷的250 ml量筒中，一般分三次收集，總共可收集80-85 ml濾液，將濾液等分到4個預冷的50 ml的塑料離心管中（每個管中的濾液不要超過35 ml）。

1.4類囊體膜收集：

  4℃ 4200 g離心15分鐘，小心(xin)棄上清，沉淀即(ji)為類囊體膜。

1.5 類囊體膜漂洗：

1.5.1 在類囊體膜沉淀中加入1 ml 預冷的類囊體膜漂洗液，手彈離心管底部使沉淀重懸；再補加1 ml預冷的類囊體(ti)膜(mo)漂(piao)洗液，徹(che)底重懸沉淀。

注：重懸時最好避免溶液起泡，手指輕彈，不要用槍頭吹打，否則容易損傷類囊體膜。

1.5.2  4度10000 g離心2分鐘，棄(qi)上清，保留沉淀。

1.6 類囊體膜重懸：

1.6.1  沉淀中加入1 ml的類囊體膜溶解液，手彈離心管底部使沉淀重懸；再補加1 ml預冷(leng)的類囊體膜溶解液(ye)，徹底(di)重懸沉淀。

 1.6.2  4℃10000 g離心2分鐘(zhong)，上清為(wei)可溶性蛋白（根(gen)據實驗需(xu)要保留），沉淀為(wei)類囊(nang)體膜組分。

1.6.3 沉(chen)淀(dian)中加入1 ml類(lei)囊體膜溶解液(ye)，輕柔重懸沉(chen)淀(dian)，合并4管溶液(ye)，即(ji)為(wei)最終(zhong)得到的類(lei)囊體膜溶液(ye)，約(yue)4 ml。

1.7 類囊體膜溶液定量：

通常(chang)類囊(nang)體膜(mo)蛋白(bai)含(han)量(liang)用單(dan)位葉(xie)綠(lv)素含(han)量(liang)來表示(shi)，即x μg 葉(xie)綠(lv)素/ml 類囊(nang)體膜(mo)溶液。

1.7.1 取(qu)5 μl 類囊體膜溶液(ye)加入到995 μl 80%丙酮溶液(ye)中(zhong)，混勻(yun)。

1.7.2 10000 g 4℃離心2分鐘，吸取上清，測定OD₆₆₃和OD₆₄₆ 吸(xi)光值，用80%丙酮(tong)做空白對照。

1.7.3 根據以下(xia)公式(shi)計(ji)算葉綠(lv)素(su)：

葉綠素濃度（μg Chl/ml）=200×（17.32×OD₆₄₆+7.18×OD₆₆₃） 注：200為稀釋倍數(shu)。

1.8 類囊體膜貯存：

將類囊體膜樣品用類囊體膜溶解液稀釋到濃度為1mg Chl/ml，根據需要適量分裝，如50 μl/管，-80℃保存。

1.9 類囊體膜樣品溶解和電泳：

類囊體膜增溶緩沖液配制：

將2.5 ml增溶緩沖液（2×）全部加入到增溶劑粉末中，加入滅菌水定容至5 ml，徹底混勻，即配成5 ml增溶緩沖液，適量分裝，-20℃貯存，盡量避免反復凍融。

1.9.1 取50 μl(濃度(du)為1 mg Chl/ml)類囊體膜樣(yang)品, 4℃ 16000 g離(li)心5分鐘，棄上(shang)清。

1.9.2 沉淀中加入50 μl類囊體膜增溶緩沖液重懸樣品（此時樣品濃度為1 mg Chl/ml），輕柔混勻，避免產生大量氣泡，冰浴10 min； 4℃ 16000 g離心15 min；上清為綠色，有微量沉淀。 注：如上清為無色，說明增溶不好。

1.10

 實(shi)驗示例：