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植物葉綠體DNA提取試劑盒        

● 產品簡介：

葉綠體（Chloroplast）是質體的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉換器，是光合作用的反應場所。在高等植物中葉綠體為雙凸或平凸透鏡，長徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的葉肉細胞一(yi)般含50～200個葉(xie)綠(lv)(lv)體(ti)，可占細胞質(zhi)的(de)(de)(de)40%，葉(xie)綠(lv)(lv)體(ti)的(de)(de)(de)數目因物種細胞類(lei)型，生態環境(jing)，生理(li)狀(zhuang)態而有(you)所(suo)不同(tong)。葉(xie)綠(lv)(lv)體(ti)由(you)葉(xie)綠(lv)(lv)體(ti)外被(chloroplast envelope)、類(lei)囊體(ti)(thylakoid)和(he)基(ji)質(zhi)(stroma)三(san)部分組成(cheng)，含有(you)3種不同(tong)的(de)(de)(de)膜(mo)(mo)：外膜(mo)(mo)、內膜(mo)(mo)、類(lei)囊體(ti)膜(mo)(mo)和(he)3種彼此分開的(de)(de)(de)腔(qiang)：膜(mo)(mo)間(jian)隙、基(ji)質(zhi)和(he)類(lei)囊體(ti)腔(qiang)。

葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體DNA（Chloroplast DNA，cpDNA），存(cun)在于葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體內(nei)，高等植(zhi)物葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體的(de)DNA為雙鏈(lian)共價(jia)閉(bi)合環狀(zhuang)分(fen)子，其長度隨生物種類而不(bu)同，其大(da)小(xiao)在120 kb到217 kb之(zhi)間，相(xiang)當(dang)于噬菌體基(ji)因(yin)組的(de)大(da)小(xiao)雙鏈(lian)環狀(zhuang)，一(yi)個(ge)葉(xie)(xie)綠(lv)(lv)體含有(you)10~50個(ge)cpDNA。

本試(shi)劑盒是(shi)結合植(zhi)(zhi)物葉綠(lv)體純(chun)化(hua)試(shi)劑盒和離心柱式植(zhi)(zhi)物DNA提取(qu)(qu)試(shi)劑盒而推出的新產品，專門用于(yu)植(zhi)(zhi)物葉綠(lv)體DNA的快(kuai)速提取(qu)(qu)。

1. 純(chun)度高(gao)，不含污染和(he)抑制劑，可以直(zhi)接用(yong)于(yu)酶切、PCR、real-time PCR、 multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting, microsatellite analysis等各種(zhong)后續分子生物(wu)學實驗(yan)。 

2. 以(yi)每次處(chu)理30 g葉(xie)片計算(suan)(suan)，本產(chan)(chan)品(pin)(pin)可(ke)使(shi)用8-10次提取植物葉(xie)綠體，每次能得到3-5 mg左右葉(xie)綠體。按照每次使(shi)用0.2 ml 葉(xie)綠體溶液(ye)計算(suan)(suan)，可(ke)以(yi)至少提取50次葉(xie)綠體DNA的純化(hua)。cpDNA 產(chan)(chan)率一般(ban)(ban)在(zai)(zai)1-2 μg/1 g葉(xie)片樣品(pin)(pin)。OD260/280一般(ban)(ban)在(zai)(zai)1.8以(yi)上。DNA片段長度一般(ban)(ban)在(zai)(zai)40-50 Kb左右。

3. 已經成功用(yong)于菠(bo)菜(cai)，大豆，萵(wo)筍，白菜(cai)，煙草和甜菜(cai)等雙子葉(xie)植(zhi)物，也適(shi)用(yong)于單(dan)子葉(xie)等其(qi)他(ta)植(zhi)物（可(ke)能需要(yao)優化條(tiao)件(jian)）。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存(cun)，至少(shao)一(yi)年(nian)有效；試劑(ji)盒常(chang)溫運輸。

● 產品組成：

● 使用說明：

一 植物葉綠體提取：

注意：葉綠體(ti)對溫度高度敏感，所(suo)以整個(ge)操作必須在(zai)冰(bing)上(shang)或者在(zai)冷室(shi)進行(xing)，所(suo)用器皿和溶(rong)液均需(xu)(xu)要在(zai)4℃預冷。葉綠體(ti)提取過程中離心時一定要在(zai)4℃進行(xing)，離心力以g而(er)不(bu)是rpm計算。如(ru)果需(xu)(xu)要研究(jiu)葉綠體(ti)的(de)功能，提取過程還(huan)需(xu)(xu)要在(zai)昏暗的(de)光(guang)線條件下進行(xing)。 

需要自備材料：

剪刀；50 ml尖底(di)或圓(yuan)底(di)離心(xin)(xin)管(guan)；15 ml尖底(di)或圓(yuan)底(di)離心(xin)(xin)管(guan)；漏斗；勻(yun)漿機；低溫(wen)離心(xin)(xin)機。

1.1 材料預處理：

實驗前1-2天將植物放在暗室培養(yang)以減少(shao)葉(xie)綠體中淀粉顆粒(li)的(de)形成，否則(ze)離(li)心時(shi)這些顆粒(li)很(hen)容易(yi)使葉(xie)綠體破(po)裂。葉(xie)片(pian)在實驗前需先(xian)用自來水(shui)洗(xi)凈，再用蒸餾(liu)水(shui)淋(lin)洗(xi)，去(qu)掉多余(yu)水(shui)分(fen)。如果葉(xie)片(pian)采(cai)集(ji)后(hou)不能立即處(chu)理，則(ze)保存時(shi)需要(yao)保持葉(xie)片(pian)濕潤，即使如此，葉(xie)片(pian)采(cai)集(ji)后(hou)的(de)放置(zhi)時(shi)間也不能超過一天。

1.2  1×葉綠體提取緩沖液（即用型）配制：

注：一個30克樣品提取反應需要 150 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈（約30克）并將葉片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在150 ml的預冷的1×葉綠體提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加5 ml）。

1.3.2 將浸泡了葉片的溶液轉移到勻漿機（貨號：RT-2243A）中，低速勻漿10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機底部后，再低速勻漿10秒，重復10秒勻漿3-4次至葉(xie)片(pian)破碎即可，不要過分勻漿，否則(ze)會(hui)降低完整(zheng)葉(xie)綠(lv)體的得率。

1.3.3 用2層過濾紙置于小漏斗上，將勻漿液過濾收集到預冷的250 ml量筒中，一般更換三次濾紙可收集約120 ml濾液，將濾液等分到4個預冷的50 ml的塑料離心管中（每個管中的濾液不要超過35 ml）。

1.4 離心去雜質：

4℃ 200 g離心5分鐘，保(bao)留上清，沉淀為未破裂植物組織、細(xi)胞(bao)(bao)或細(xi)胞(bao)(bao)核（下圖）；如(ru)果(guo)樣品中淀粉含量(liang)較高(gao)，沉淀可(ke)能為白色。

注：此步驟用低速離心去除雜質，不能省略，否則得到的葉綠體DNA中會有核基(ji)因組的污染。

1.5 收集葉綠體粗提液：

1.5.1將步驟1.4得到的上清液平分到4個預冷的50 ml塑料離心管中；4℃ 1100 g離心15分(fen)鐘，小(xiao)心棄上清，沉(chen)淀含葉綠(lv)體，呈深綠(lv)色(se)（下(xia)圖）。

1.5.2 在沉淀中加入1.5 ml 預冷的1×葉綠體提取緩沖液（即用型），手彈離心管底部使葉綠體重懸，收集4管溶液（約6 ml），此溶液(ye)即為葉綠體粗(cu)提產物。

1.5.3 如果對葉綠體DNA是否含細胞核DNA的要求不高，則葉綠體粗提液可以直接用于葉綠體DNA純化（步驟2.1）。

1.6 完整葉綠體的純化：

葉綠體重懸液配制

1.6.1 單梯度分離法（適合菠菜，白菜，萵苣，擬南芥，綠蘿等）：

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml：

在15 ml離心管中加入6 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和4 ml密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得40%密度梯度液，冰浴備用(yong)。

1.6.1.2將10 ml 40%密度梯度液平分到2個 15 ml離心管中，每管5 ml；將步驟1.5.2得到的葉綠體粗提液3 ml小心鋪在5 ml密度梯度液之上；另一管重復。（5 ml 40%密度梯度液用可以分離3 ml 葉綠(lv)體(ti)粗提液，其他(ta)體(ti)積以此比例換算(suan)）。

1.6.1.3  4℃ 3200 g離心30分(fen)鐘(zhong)，綠(lv)色沉淀為(wei)完整葉綠(lv)體（下圖(tu)）。

注：如果最上層的分離試劑不夠清亮，可以延長離心20分鐘。

1.6.1.4 小心棄上清，保留沉淀，每管沉淀中加入1 ml 葉綠體重懸液，輕柔重懸，可以收集到2 ml完(wan)整葉綠體溶液。

1.6.1.5 此葉綠體溶液可以提取得到無細胞核DNA污染的葉綠體DNA  

（步驟2.1）。

1.6.2雙梯度分離法（適合煙草，甜菜，豌豆等）：

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml：

在15 ml離心管中加入0.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制-8 ml：

在另一15 ml離心管加入4.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得40%密度梯度輕液。

1.6.2.3 取一只15 ml離心管，加入1.86 ml 80%密度梯度重液，隨后取3.74 ml 40%密度梯度輕液小心鋪在80%密度梯度重液之上，冰浴備用；然后取步驟1.5.2得到的3 ml葉綠體粗(cu)提液(ye)小(xiao)心鋪在(zai)密度(du)梯度(du)輕(qing)液(ye)之上。另一管重復(fu)。

注：每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可以分離3 ml 葉綠體(ti)(ti)粗提液(ye)；其他(ta)體(ti)(ti)積按照比例調整。

1.6.2.4 4℃ 3200 g離心30分鐘(zhong)，上(shang)層綠(lv)色(se)帶(dai)含破碎的葉綠(lv)體(ti)、線粒體(ti)和核糖(tang)體(ti)等，重(zhong)液(ye)和輕液(ye)間的綠(lv)色(se)帶(dai)為完整葉綠(lv)體(ti)（下(xia)圖）。

注：如果最上層的分離試劑不夠清亮，可以延長離心20分鐘。

1.6.2.5 重懸葉綠體：

用廣口吸管小心將重液和輕液之間的綠色帶（完整葉綠體）轉  移到新的15 ml離心管中，加(jia)入三倍體積預冷的葉綠體重(zhong)懸液，輕柔(rou)混(hun)勻。

1.6.2.6 離心收集葉綠體(ti)：

4℃ 1750 g離心6分鐘，小心將上清倒出后，在綠色的葉綠體沉淀中加入預冷的1 ml葉綠體重懸液，手指輕彈管底使葉綠體重懸。最終可以收集到2 ml完整葉綠體溶液。

1.6.2.7此葉綠體溶液可以提取得到無細胞核DNA污染的葉綠體DNA（步驟2.1）。

1.7 葉綠體貯存：

葉綠體可在顯微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體重懸液避光-80℃保存。葉綠體(ti)必須盡快使用(yong)，否(fou)則非常容易失去活性。

1.8 葉綠素含量測定：

通常葉綠(lv)體含量(liang)用單位葉綠(lv)素含量(liang)來表示，即x mg 葉綠(lv)素/ml 葉綠(lv)體懸(xuan)浮液。

1.8.1 取10 μl 葉綠體懸浮(fu)液加入到(dao)990 μl 80%丙酮溶(rong)液中(zhong)，混勻。

1.8.2 3000 g 離心5分鐘，取上清測定OD₆₅₂ 吸光值，用80%丙酮(tong)做空白對照(zhao)。

1.8.3 根據以下公式計算葉綠素：

葉綠素濃度（mg/ml）=（OD₆₅₂×100）/36

100：稀釋倍數

36：extinction coefficient in ml/cm·mg

二 葉綠體DNA提取：

注：以下離心操作可以常溫下進行。

2.1 取(qu)0.2-0.4 ml葉(xie)綠體(ti)溶液，3500 g離心2分鐘，小(xiao)心棄上清，沉淀為葉(xie)綠體(ti)。

   注：可以(yi)根據提(ti)取(qu)(qu)的葉綠(lv)(lv)體(ti)濃度(du)大(da)體(ti)估算提(ti)取(qu)(qu)到的cpDNA濃度(du)。經驗值(zhi)：每50 μg 葉綠(lv)(lv)體(ti)（葉綠(lv)(lv)素濃度(du)）可以(yi)提(ti)取(qu)(qu)到1μg cpDNA。

2.2葉(xie)綠體沉淀中加入400 μl 緩沖(chong)液AP1和6 μl RNaseA (10mg/ml)，漩渦(wo)震(zhen)蕩1分鐘。

2.3 將離心管放在65℃水浴10分鐘，水浴過(guo)程(cheng)中顛倒離心(xin)管(guan)以混合樣品(pin)數次。

2.4 加入130 μl 緩沖液AP2，顛倒(dao)混(hun)勻，冰浴5分鐘。

2.5 12,000 rpm離心5分鐘，保留上清，上清通常為無色，沉淀為綠色。注：此步驟(zou)離心去(qu)除去(qu)垢劑(ji)，蛋白以及多糖等(deng)雜質。

2.6 將上(shang)清(qing)（通常(chang)可取(qu)到(dao)400 μl）轉(zhuan)移到(dao)1.5 ml離心管中，加入1.5倍體積（例如400 μl的上(shang)清(qing)液加600 μl）緩沖液AP3（使用前(qian)請(qing)注意是否已經加入無水(shui)乙醇），立即(ji)顛倒混勻，簡(jian)短(duan)離心以(yi)去除管蓋內壁的水(shui)珠。

2.7吸取步驟2.6中的混合液加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放回收集管中。

注：離(li)心(xin)吸附柱(zhu)的最大容(rong)積是700 μl，如果一次(ci)不能完全(quan)上(shang)柱(zhu)，可以分次(ci)上(shang)柱(zhu)離(li)心(xin)，保(bao)證(zheng)全(quan)部溶(rong)液全(quan)部加到離(li)心(xin)柱(zhu)中。

2.8向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液(ye)PW（使用前(qian)請(qing)先(xian)檢(jian)查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心(xin)1分鐘，倒掉(diao)廢液(ye)，吸附柱CG放入收(shou)集(ji)管中。

2.9向吸附(fu)柱CG中加(jia)(jia)入500 μl漂(piao)洗液PW（使(shi)用前請先檢查是否已加(jia)(jia)入無(wu)水乙(yi)醇(chun)），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉廢(fei)液，吸附(fu)柱CG放(fang)入收集管中。

2.10將(jiang)吸附柱CG放回廢液收集管中，12,000 rpm離心(xin)2分鐘。

注：此步驟非常重要，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液(ye)去除(chu)。漂洗液(ye)中乙醇的殘留會影響后續(xu)的酶(mei)反(fan)應（酶(mei)切、PCR等）實驗。

2.11將吸附柱CG轉入一個干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100 μl經65℃水浴預熱(re)的洗(xi)脫緩沖液EB，室溫放置2分(fen)(fen)鐘(zhong)，12,000 rpm g離心2分(fen)(fen)鐘(zhong)。

注(zhu)：洗(xi)脫(tuo)緩沖液體積不要少于(yu)50 μl，體積過小影(ying)響回收效率(lv)；洗(xi)脫(tuo)液的pH值對于(yu)洗(xi)脫(tuo)效率(lv)有很(hen)大影(ying)響。若用水做(zuo)洗(xi)脫(tuo)液應保證其pH值在7.0-8.5范(fan)圍內，pH值低于(yu)7.0會降低洗(xi)脫(tuo)效率(lv)。

2.12  葉綠體DNA產物-20℃保存。

三 實驗示例：

3.1 葉綠體提取示例：

30克綠蘿葉片，加入150 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）  勻漿5×10秒，3次過濾共收集120 ml過濾液，平分4管，4℃ 1100 g 離心15 min，棄上清，每管重懸于1.5 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）中，共得到6 ml 葉綠體粗提液。2×3 ml 粗提液平鋪于2×5 ml 40%密度梯度液之上，4℃ 3200 g離心(xin)15分鐘，棄上清，每(mei)管沉淀重(zhong)(zhong)懸(xuan)于1 ml 葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)體重(zhong)(zhong)懸(xuan)液(ye)中，共(gong)得到(dao)2 ml精制葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)體重(zhong)(zhong)懸(xuan)液(ye)，測定葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)素含量為3.43 mg/ml重(zhong)(zhong)懸(xuan)液(ye)。30克葉(xie)(xie)(xie)片提取(qu)得到(dao)6.86 mg葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)體。取(qu)10 μl葉(xie)(xie)(xie)綠(lv)體溶液(ye)稀釋20倍，取(qu)50 μl稀釋液(ye)顯微鏡40倍物(wu)鏡觀(guan)察，如下圖。

3.2 葉綠體DNA電泳示例：

葉綠體提取同3.1。取100 μl葉綠體重懸液，提取cpDNA，最后用50 μl洗脫，上樣5 μl，電泳結果見下圖左二泳道，cpDAN大小約20kb，無可見核基因組污染。