2×ligation solution MasterMix
2×DNA連接緩沖液
● 產品組成(cheng)：
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貨號
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名稱
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規(gui)格
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RTV701
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2×ligation solution MasterMix
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150 μl
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注；按(an)照10μl連接體(ti)(ti)系計算，每(mei)次使用5μl，可以使(shi)用30次。
● 保存：-20℃
● 產品(pin)簡介：
2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，實驗時，只需加入片段和載體即可進行(xing)連接(jie)反應。
適用于DNA片段和載體(ti)DNA的(de)連接以及(ji)DNA片段和Linker或Adaptor DNA的連接。
● 注意事項
1．2×ligation solution MasterMix由于含(han)有T4 DNA ligase，使用(yong)前(qian)冰(bing)浴中徹(che)底融化，混勻(yun)后使用(yong)。
2．為了提(ti)高轉化效率，轉化時(shi)建(jian)議所加入連接產(chan)物的(de)量不要超(chao)過感(gan)受態細胞(bao)體(ti)積的(de)10%。
● 使用(yong)方法：
一 DNA片段(duan)和載體(ti)DNA的連(lian)接(jie)
1）粘性末(mo)端的連接
1．反應體系(xi):
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10μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1*
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：載體與插入片段(duan)的摩爾數比需(xu)要優化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可(ke)得到較(jiao)好(hao)的結果。用以下(xia)公式計算片段(duan)摩爾(er)數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如(ru)：插入片段2000bp，線(xian)性載體(ti)為3000bp，如果(guo)載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾(er)比(bi)是1:3，則需要(yao)2000bp pmol數為(wei)0.075pmol，插(cha)入片段2000bp的使(shi)用量為100ng。
2．徹底(di)(di)輕(qing)柔(rou)混勻后，瞬(shun)間離心，將管(guan)壁上的溶液收集到管(guan)底(di)(di)。
3．反應(ying)條(tiao)件：16℃孵育30分鐘。
4．可取(qu)5 μl連接產物熱擊(ji)轉化50 μl感受態細(xi)胞或取1-2 μl連(lian)接產物電擊轉化50 μl感受態細胞。
注：1）若要提高電轉實驗效率，推薦65℃孵育10分鐘或(huo)70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產物純化試劑盒(he)或氯仿(fang)抽提對連接后的DNA片段(duan)進(jin)行(xing)純化(hua)后進(jin)行(xing)電擊轉化(hua)。
2）若(ruo)要提高轉(zhuan)化子(zi)數目，可將連接時間延長至1小(xiao)時(shi)。
2）平末端的連接
1．反(fan)應體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性平末端載體DNA*
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x μl
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10-50 ng
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插入(ru)DNA片段
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y μl
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插入片(pian)段：載(zai)體=1:1-5:1**
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：平滑末(mo)端的載(zai)體與 DNA 片(pian)段(duan)進(jin)行連接(jie)時，應首(shou)先(xian)將載體進(jin)行去磷(lin)酸化(hua)處理，以防止其自身環化(hua)。
**：載(zai)體與插入片段的(de)摩爾數比需要優化(hua)：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可(ke)得到(dao)較好的(de)結果(guo)。用以下公式計算片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如：插入片段2000bp，線性載(zai)體為3000bp，如果載體使用量為(wei)50ng（0.025pmol），10μl連接(jie)體系中(zhong)vector:insert的(de)摩爾(er)比是1:3，則(ze)需要(yao)2000bp pmol數為0.075pmol，插入片(pian)段2000bp的使用量(liang)為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液(ye)收集到管底。
3．反應條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5 μl連接(jie)產物熱擊轉化50 μl感受(shou)態(tai)細胞(bao)或取1-2 μl連接產物(wu)電擊轉(zhuan)化50 μl感(gan)受態細胞。
注：1）若(ruo)要提(ti)高電轉實驗效率，推薦(jian)65℃孵育10分鐘或(huo)70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產物純化試劑盒或(huo)氯仿(fang)抽提(ti)對連接(jie)后的DNA片段進行純化(hua)后才(cai)能(neng)進行電擊轉化(hua)。
2）若(ruo)要提高轉(zhuan)化子數目(mu)，可將(jiang)連接(jie)時間延(yan)長至1小時。
二 線性DNA的自身環化
1．反(fan)應(ying)體(ti)系(xi):
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10μl體系(xi)
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終(zhong)濃度
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線(xian)性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．徹底(di)輕柔混勻后，瞬間離心，將(jiang)管壁上的溶液(ye)收集到管底(di)。
3．反應條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5 μl連接產物熱擊轉化50 μl感(gan)受(shou)態細胞或取1-2 μl連接產物電擊轉(zhuan)化50 μl感受態細胞。
注：1）若要(yao)提高電轉(zhuan)實驗效率(lv)，推薦(jian)65℃孵(fu)育10分鐘或70℃孵(fu)育5分鐘滅(mie)活T4 DNA Ligase后(hou)，用DNA產物(wu)純(chun)化試劑盒或氯仿抽提(ti)對(dui)連接(jie)后(hou)的DNA片(pian)段(duan)進行純化后(hou)才能進行電擊轉化。
三 接頭連接
1．反應體系:
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10μl體系
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終濃度(du)
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線性DNA
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x μl
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100-300 ng
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磷酸化(hua)接頭
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y μl
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0.5-1 μg
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．徹底(di)輕柔混(hun)勻(yun)后(hou)，瞬間離心，將(jiang)管壁上的溶液收(shou)集到(dao)管底(di)。
3．反應條件：16℃孵育30分鐘。
4．65℃孵育10分鐘或(huo)70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase。連接產物可以直接進行限制性內切(qie)酶酶切(qie)反應。