X-Gal/IPTG即(ji)用型溶液
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產品編(bian)號
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產(chan)品名稱(cheng)
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包裝
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貯(zhu)存
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XG0516
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X-Gal
20mg/ml
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5ml
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-20℃
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IP0560
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IPTG
50mg/ml
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5ml
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-20℃
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說明書
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一份(fen)
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● 產(chan)品簡介(jie)：
藍(lan)白斑篩選(xuan)是重組子篩選(xuan)的(de)(de)一種方法。現(xian)在使用(yong)的(de)(de)許(xu)多載(zai)體(ti)都帶有(you)(you)一個(ge)大腸桿菌的(de)(de)DNA的(de)(de)短區段(duan)，其中有(you)(you)β-半乳糖苷(gan)酶(mei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)（lacZ）的(de)(de)調控序列(lie)和(he)前146個(ge)氨(an)基(ji)(ji)酸的(de)(de)編(bian)碼(ma)信(xin)息(xi)。在這個(ge)編(bian)碼(ma)區中插入(ru)了(le)一個(ge)多克隆位點（MCS），它(ta)并不(bu)破壞閱讀框，但可(ke)使少數幾個(ge)氨(an)基(ji)(ji)酸插入(ru)到β-半乳糖苷(gan)酶(mei)的(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)端而不(bu)影(ying)響功能，這種載(zai)體(ti)適用(yong)于(yu)可(ke)編(bian)碼(ma)β-半乳糖苷(gan)酶(mei)C端部分序列(lie)的(de)(de)宿(su)(su)主細胞(bao)(bao)。因(yin)(yin)此，宿(su)(su)主和(he)質粒編(bian)碼(ma)的(de)(de)片段(duan)雖(sui)都沒(mei)有(you)(you)酶(mei)活(huo)(huo)性，但它(ta)們同時存在時，可(ke)形成(cheng)具有(you)(you)酶(mei)學活(huo)(huo)性的(de)(de)蛋白質。這樣，lacZ基(ji)(ji)因(yin)(yin)在缺少近(jin)操縱(zong)基(ji)(ji)因(yin)(yin)區段(duan)的(de)(de)宿(su)(su)主細胞(bao)(bao)與(yu)帶有(you)(you)完整近(jin)操縱(zong)基(ji)(ji)因(yin)(yin)區段(duan)的(de)(de)質粒之間(jian)實現(xian)了(le)互補(bu)，稱為α-互補。由(you)α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作(zuo)用下，在生色底(di)物X-Gal存(cun)在時產生藍色菌落(luo)，因而易于識別。然而，當(dang)外源DNA插入到質粒的多克(ke)隆位點后(hou)，幾乎(hu)不可避免(mian)地導致(zhi)無α-互補能力的(de)(de)氨基端片(pian)段(duan)，使得帶有重(zhong)組質(zhi)粒的(de)(de)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)形成(cheng)白(bai)色菌(jun)(jun)(jun)(jun)落(luo)。這種重(zhong)組子的(de)(de)篩(shai)選，又(you)稱為藍(lan)白(bai)斑(ban)篩(shai)選。如(ru)用藍(lan)白(bai)斑(ban)篩(shai)選則經連(lian)接產物(wu)轉化(hua)的(de)(de)鈣化(hua)菌(jun)(jun)(jun)(jun)平板(ban)37℃倒(dao)置培養12-16hr后，含有插入片(pian)段(duan)重(zhong)組質(zhi)粒的(de)(de)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)形成(cheng)白(bai)色菌(jun)(jun)(jun)(jun)落(luo)，而沒(mei)有插入片(pian)段(duan)的(de)(de)質(zhi)粒細菌(jun)(jun)(jun)(jun)形成(cheng)藍(lan)色菌(jun)(jun)(jun)(jun)落(luo)。
● 配制方法：
50mg/ml IPTG 5ml：取250mg IPTG，溶(rong)于5ml無菌水中(zhong)，過濾除(chu)菌后-20℃貯存。
20mg/ml
X-Gal 5ml：取(qu)100mg X-gal，溶于5ml 二甲(jia)基甲(jia)酰胺（DMF），棕色瓶中-20℃貯存。此試劑無需滅菌(jun)。
● 實驗(yan)程序：
1 轉化(hua)平(ping)板的制備：
向鋪好的含有相應抗(kang)生素的固(gu)體瓊脂(zhi)平板表面加入16 μl的IPTG(50 mg/ml)、40 μl的X-gal(20 mg/ml)，使(shi)用無(wu)菌的彎(wan)頭玻璃棒將其均(jun)勻(yun)的涂(tu)開，盡量(liang)使(shi)溶解(jie)X-gal的二甲基甲酰胺揮發干凈(jing)。
2 轉化
i.
取(qu)部(bu)分連(lian)接產(chan)物加(jia)(jia)到50-100 μl感受態(tai)細(xi)胞中(zhong)（感受態(tai)細(xi)胞應(ying)剛(gang)從-70℃冰箱取(qu)出放于冰浴上(shang)，待剛(gang)剛(gang)解凍(dong)時加(jia)(jia)入(ru)連(lian)接產(chan)物，連(lian)接產(chan)物的加(jia)(jia)入(ru)量不超(chao)過感受態(tai)細(xi)胞體(ti)積(ji)的十分之一(yi)），輕彈混(hun)勻，冰浴30分鐘(zhong)。
ii.
將離(li)心管置于精(jing)確42℃水浴(yu)90秒(miao)，取出(chu)管后立即置于冰浴(yu)中放(fang)置2-3分鐘，其間不要搖動離(li)心管。
iii.
向離心管中加入250-500 μl37℃預熱的SOC或LB(不含抗生素)培養(yang)基(ji)，150rpm，37℃振(zhen)蕩培養(yang)45分鐘。此(ci)步目的是(shi)使質粒上相關(guan)的抗性標記基(ji)因表達，使菌(jun)體(ti)復(fu)蘇(su)。
iv. ;
將離心管中的(de)菌液混勻，吸取100 μl加(jia)到含相應抗(kang)生素(su)的(de)SOB或(huo)LB固體瓊脂培(pei)養基上，用無菌的(de)彎頭玻棒輕(qing)輕(qing)的(de)將細胞均勻涂開(kai)。待平板表面(mian)干燥(zao)后，倒置平板，37℃培(pei)養12-16小時。
3
檢測
將得到的白色菌落接(jie)種1-5 ml LB培(pei)養基(ji)，37℃搖(yao)床振蕩培(pei)養過夜，保存菌種后提取質粒，應用(yong)PCR或酶切方(fang)法鑒定(ding)插入片段是否正(zheng)確。
X-gal/IPTG發表文章列表：
1. [2022
IF=2.7] Functional verification of the JmLFY gene associated with the
flowering of Juglans mandshurica Maxim..
Author: Jiayou Cai, Ruoxue Jia, Ying Jiang, Jingqi Fu, Tianyi Dong,
Jifeng Deng, Lijie Zhang.
Journal: Peer J Published
March 7, 2023
Institution: Shenyang Agricultural University
Paper
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