細胞膜(mo)紅色(se)熒(ying)光染色(se)試劑(ji)盒（DiI）
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貨號
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產品名稱(cheng)
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規格
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CD2040
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細胞膜(mo)紅色(se)熒(ying)光染色(se)試劑盒(he)（DiI）
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200-1000次
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● 產(chan)品(pin)介(jie)紹：
細胞(bao)膜紅(hong)色熒(ying)光染色試劑盒(he)(he)(DiI)，Cell
Plasma Membrane Staining Kit with DiI (Red Fluorescence)是一(yi)種以(yi)DiI為熒(ying)光探針，能夠(gou)快速靈敏地(di)對(dui)細胞(bao)膜進行(xing)紅(hong)色熒(ying)光染色標記(ji)的(de)試劑盒(he)(he)。
DiI在進入(ru)細(xi)胞膜之前(qian)熒(ying)(ying)光(guang)非常弱，僅當進入(ru)到細(xi)胞膜后才可(ke)以被(bei)激(ji)發(fa)出很強的熒(ying)(ying)光(guang)。DiI被(bei)激(ji)發(fa)后可(ke)以發(fa)出橙紅色的熒(ying)(ying)光(guang)，DiI和(he)磷酯雙層膜結合后的激(ji)發(fa)光(guang)譜和(he)發(fa)射光(guang)譜參(can)考上圖。其中(zhong)，最(zui)大激(ji)發(fa)波(bo)長為(wei)549nm，最(zui)大發(fa)射波(bo)長為(wei)565nm。
本(ben)試(shi)劑盒如果用(yong)于流式細胞(bao)儀，每(mei)個樣品的檢測(ce)體(ti)系體(ti)積為0.5 ml時，可以進(jin)行(xing)200次檢測(ce)；96孔板每(mei)孔檢測(ce)體(ti)系的體(ti)積為100 μl時可以進(jin)行(xing)1000次檢測(ce)。
● 產品組成：
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組份貨號
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產(chan)品名(ming)稱
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規格(ge)
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貯(zhu)存
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CD2040-01
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DiI（400×）
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0.25
ml
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-20℃
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CD2040-02
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染色緩(huan)沖液(ye)
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100
ml
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4℃
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-
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說明書
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1份
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● 貯存：
DiI（400×） -20℃避光保(bao)存，一年有效。染色緩沖液可(ke)以4℃貯存。
● 使(shi)用(yong)說明(ming)：
1. 細胞膜染色工作液制(zhi)備：
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細胞膜染色(se)工作(zuo)液配制量
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1 ml
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10 ml
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DiI（400×）
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2.5 μl
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25 μl
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染色緩沖(chong)液
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997.5 μl
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9.975 ml
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細胞(bao)膜染色(se)工(gong)作(zuo)液的(de)用(yong)量(liang)：對于6、12、24、96孔板(ban)，每孔的(de)細胞(bao)膜染色(se)工(gong)作(zuo)液分別(bie)為1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和(he)50~100μl；對于流式細胞(bao)樣品(pin)(pin)，每個(ge)(ge)樣品(pin)(pin)的(de)細胞(bao)膜染色(se)工(gong)作(zuo)液為0.5ml；對于切(qie)(qie)片，可(ke)以根據切(qie)(qie)片大小(xiao)，每個(ge)(ge)切(qie)(qie)片使(shi)用(yong)100-200μl的(de)細胞(bao)膜染色(se)工(gong)作(zuo)液。
注：不同(tong)細胞的最(zui)佳染色(se)濃度(du)(du)略有不同(tong)，細胞膜染色(se)工作液的最(zui)終濃度(du)(du)建議(yi)根(gen)據不同(tong)細胞系(xi)和實(shi)驗(yan)體系(xi)進(jin)行優化，可在1:100-1:400之間進(jin)行調整。
2. 懸浮活細胞(bao)染(ran)色(se)：
2.1
加入(ru)適當(dang)體積(ji)的(de)細胞(bao)(bao)膜(mo)染色(se)工作液(ye)重懸細胞(bao)(bao)，使其密度為1×106/ml左右。
2.2
37℃避光孵(fu)(fu)育(yu)細(xi)胞5-20
min，不(bu)同的細(xi)胞最(zui)佳孵(fu)(fu)育(yu)時(shi)間(jian)不(bu)同。以5
min作為初始孵(fu)(fu)育(yu)時(shi)間(jian)，根據實際所用(yong)的細(xi)胞優化染色時(shi)間(jian)，以得(de)到最(zui)佳的熒光染色效(xiao)果(guo)。
2.3
500×g常溫(wen)離心5
min。
2.4
吸除(chu)上清液，緩慢加(jia)入37℃預熱的細(xi)胞(bao)(bao)培養液重(zhong)懸細(xi)胞(bao)(bao)。
2.5
用細胞培(pei)養重復漂洗沉淀一次(ci)。
2.6
流式細(xi)胞儀(yi)檢測(ce)，或將細(xi)胞封(feng)片(pian)觀察，封(feng)片(pian)時(shi)請避免使用含有甘油或其它有機物的封(feng)片(pian)劑，否則會影響染色并增加(jia)熒光背景，可以(yi)直接(jie)用PBS封(feng)片(pian)，在(zai)熒光顯微鏡(jing)下觀察。
3. 貼壁活細胞染色：
3.1
將貼(tie)壁細(xi)胞種于細(xi)胞培養皿、多孔細(xi)胞培養板或者細(xi)胞爬(pa)片上。
3.2
吸除細胞培(pei)養(yang)液，用PBS洗滌細胞2次。
3.3
加入適(shi)當體積的細胞膜染色工(gong)作液，輕(qing)輕(qing)晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。
3.4
37℃避光孵育細(xi)胞(bao)5-20
min，不同的細(xi)胞(bao)最佳培養時間不同。以(yi)5min作為(wei)初(chu)始孵育時間，根據實際所用的細(xi)胞(bao)優(you)化染(ran)色時間，以(yi)得到最佳的熒光染(ran)色效果。
3.5
吸除(chu)細(xi)(xi)胞膜染色工作液，用(yong)PBS洗(xi)滌2次，然后加入(ru)37℃預熱的細(xi)(xi)胞培養液即(ji)可在(zai)熒光顯微鏡下(xia)觀察。
4. 固定后細胞或切(qie)片的染色：
注(zhu)：DiI不建議用于固定后(hou)細胞(bao)或組織的染(ran)色，因(yin)為(wei)細胞(bao)固定后(hou)影響了(le)細胞(bao)膜(mo)的結構，不能(neng)準確反(fan)映熒光(guang)標記位置。以下(xia)步驟僅供參考：
4.1.
使用(yong)4%多聚甲(jia)醛固定(ding)液進行固定(ding)。
4.2
吸除固(gu)定(ding)液(ye)，用PBS洗滌(di)細胞3遍。
4.3
使用(yong)配制(zhi)在PBS中的0.1%
Triton X-100進行通透，常溫10 min。然后(hou)用(yong)PBS洗滌細胞3遍。
4.4按照(zhao)免疫染色的(de)方(fang)法進行抗體的(de)孵育或用其它染料進行染色。注意：抗體孵育步驟中(zhong)的(de)封閉液、抗體稀釋液及(ji)洗滌液不能(neng)含有去垢劑。
4.5加入適當體積的細(xi)胞(bao)膜(mo)染色工作液，輕(qing)輕(qing)晃動使(shi)染料均勻(yun)覆蓋所(suo)有細(xi)胞(bao)或(huo)樣品。
4.6
37℃避光孵育5-20
min，最佳(jia)染色(se)時(shi)間需要(yao)根據(ju)自(zi)己的實驗條件摸(mo)索，以達到最佳(jia)的熒光染色(se)效(xiao)果(guo)。
4.7吸(xi)除細胞(bao)膜染色(se)工作液，用(yong)PBS洗滌2-3次，隨后(hou)即可在熒光(guang)顯微鏡下觀察。
● 實(shi)驗示例：
操(cao)作程(cheng)序：293細胞(bao)調整密度1×105/ml，接種到6孔板中(zhong)，培(pei)養30小時；去除培(pei)養基，PBS漂洗一次；33342染色(se)37度10分鐘，去除33342染色(se)液，加1.5
ml PBS，觀察拍(pai)照（40×）（圖(tu)A）；去除PBS，DiI染色(se)，37度10分鐘，去除DiI染色(se)液，加1.5ml PBS，觀察拍(pai)照（40×）（圖(tu)B）