細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒（DiI）
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貨號(hào)
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產(chǎn)品名稱
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規(guī)格
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CD2040
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細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒（DiI）
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200-1000次
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● 產(chǎn)品介紹：
細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)，Cell
Plasma Membrane Staining Kit with DiI (Red Fluorescence)是一種以DiI為熒光探針，能夠快速靈敏地對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行紅色熒光染色標(biāo)記的試劑盒。
DiI在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，僅當(dāng)進(jìn)入到細(xì)胞膜后才可以被激發(fā)出很強(qiáng)的熒光。DiI被激發(fā)后可以發(fā)出橙紅色的熒光，DiI和磷酯雙層膜結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考上圖。其中，最大激發(fā)波長(zhǎng)為549nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為565nm。
本試劑盒如果用于流式細(xì)胞儀，每個(gè)樣品的檢測(cè)體系體積為0.5 ml時(shí)，可以進(jìn)行200次檢測(cè)；96孔板每孔檢測(cè)體系的體積為100 μl時(shí)可以進(jìn)行1000次檢測(cè)。
● 產(chǎn)品組成：
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組份貨號(hào)
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產(chǎn)品名稱
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規(guī)格
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貯存
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CD2040-01
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DiI（400×）
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0.25
ml
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-20℃
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CD2040-02
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染色緩沖液
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100
ml
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4℃
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-
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說明書
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1份
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● 貯存：
DiI（400×） -20℃避光保存，一年有效。染色緩沖液可以4℃貯存。
● 使用說明：
1. 細(xì)胞膜染色工作液制備：
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細(xì)胞膜染色工作液配制量
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1 ml
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10 ml
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DiI（400×）
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2.5 μl
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25 μl
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染色緩沖液
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997.5 μl
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9.975 ml
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細(xì)胞膜染色工作液的用量：對(duì)于6、12、24、96孔板，每孔的細(xì)胞膜染色工作液分別為1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；對(duì)于流式細(xì)胞樣品，每個(gè)樣品的細(xì)胞膜染色工作液為0.5ml；對(duì)于切片，可以根據(jù)切片大小，每個(gè)切片使用100-200μl的細(xì)胞膜染色工作液。
注：不同細(xì)胞的最佳染色濃度略有不同，細(xì)胞膜染色工作液的最終濃度建議根據(jù)不同細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行優(yōu)化，可在1:100-1:400之間進(jìn)行調(diào)整。
2. 懸浮活細(xì)胞染色：
2.1
加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液重懸細(xì)胞，使其密度為1×106/ml左右。
2.2
37℃避光孵育細(xì)胞5-20
min，不同的細(xì)胞最佳孵育時(shí)間不同。以5
min作為初始孵育時(shí)間，根據(jù)實(shí)際所用的細(xì)胞優(yōu)化染色時(shí)間，以得到最佳的熒光染色效果。
2.3
500×g常溫離心5
min。
2.4
吸除上清液，緩慢加入37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
2.5
用細(xì)胞培養(yǎng)重復(fù)漂洗沉淀一次。
2.6
流式細(xì)胞儀檢測(cè)，或?qū)⒓?xì)胞封片觀察，封片時(shí)請(qǐng)避免使用含有甘油或其它有機(jī)物的封片劑，否則會(huì)影響染色并增加熒光背景，可以直接用PBS封片，在熒光顯微鏡下觀察。
3. 貼壁活細(xì)胞染色：
3.1
將貼壁細(xì)胞種于細(xì)胞培養(yǎng)皿、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者細(xì)胞爬片上。
3.2
吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。
3.3
加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。
3.4
37℃避光孵育細(xì)胞5-20
min，不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同。以5min作為初始孵育時(shí)間，根據(jù)實(shí)際所用的細(xì)胞優(yōu)化染色時(shí)間，以得到最佳的熒光染色效果。
3.5
吸除細(xì)胞膜染色工作液，用PBS洗滌2次，然后加入37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液即可在熒光顯微鏡下觀察。
4. 固定后細(xì)胞或切片的染色：
注：DiI不建議用于固定后細(xì)胞或組織的染色，因?yàn)榧?xì)胞固定后影響了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，不能準(zhǔn)確反映熒光標(biāo)記位置。以下步驟僅供參考：
4.1.
使用4%多聚甲醛固定液進(jìn)行固定。
4.2
吸除固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3遍。
4.3
使用配制在PBS中的0.1%
Triton X-100進(jìn)行通透，常溫10 min。然后用PBS洗滌細(xì)胞3遍。
4.4按照免疫染色的方法進(jìn)行抗體的孵育或用其它染料進(jìn)行染色。注意：抗體孵育步驟中的封閉液、抗體稀釋液及洗滌液不能含有去垢劑。
4.5加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞或樣品。
4.6
37℃避光孵育5-20
min，最佳染色時(shí)間需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)條件摸索，以達(dá)到最佳的熒光染色效果。
4.7吸除細(xì)胞膜染色工作液，用PBS洗滌2-3次，隨后即可在熒光顯微鏡下觀察。
● 實(shí)驗(yàn)示例：
操作程序：293細(xì)胞調(diào)整密度1×105/ml，接種到6孔板中，培養(yǎng)30小時(shí)；去除培養(yǎng)基，PBS漂洗一次；33342染色37度10分鐘，去除33342染色液，加1.5
ml PBS，觀察拍照（40×）（圖A）；去除PBS，DiI染色，37度10分鐘，去除DiI染色液，加1.5ml PBS，觀察拍照（40×）（圖B）