Hoechst 33258染色液（Hoechst
Stain Solution,10 μg/ml）
● 產品組成(cheng)：
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組分貨號
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名(ming)稱
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規格(ge)
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貯存
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HE1012S
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Hoechst染色溶液
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10
ml
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-20℃
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說明書
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一份
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● 產品簡介(jie)：
Hoechst 33258也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分(fen)子式為C25H24N6O·3HCl，分子量為533.88，CAS Number 23491-45-4。Hoechst 33258是一種可以(yi)穿透(tou)細(xi)胞(bao)(bao)膜的藍色熒光染料，對細(xi)胞(bao)(bao)的毒(du)性(xing)較低，常(chang)用(yong)于細(xi)胞(bao)(bao)凋亡檢(jian)(jian)測(ce)，染色后可用(yong)熒光顯微鏡觀(guan)察或(huo)流式細(xi)胞(bao)(bao)儀檢(jian)(jian)測(ce)。Hoechst 33258也(ye)用(yong)于普通的細(xi)胞(bao)(bao)核染色、DNA染色。
Hoechst 33258和Hoechst
33342相比，Hoechst 33342對(dui)細(xi)(xi)胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力較33342弱，染(ran)活細(xi)(xi)胞時(shi)容易被"泵出"，也就(jiu)是拒染(ran)。所以(yi)一般來說(shuo)Hoechst 33258用于細(xi)(xi)胞固定(ding)后再染(ran)色，而Hoechst33342則可以(yi)對(dui)活細(xi)(xi)胞直(zhi)接(jie)進行染(ran)色。
Hoechst 33258的最(zui)大(da)激發波(bo)長為346nm，最(zui)大(da)發射波(bo)長為460nm，Hoechst 33258和雙鏈DNA結合后，最(zui)大(da)激發波(bo)長為352nm， 最(zui)大(da)發射波(bo)長為461nm。
本Hoechst 33258染色液為即用型，可直(zhi)接用于固(gu)定(ding)細(xi)胞(bao)(bao)或組織(zhi)的細(xi)胞(bao)(bao)核染色，也(ye)可直(zhi)接用于活細(xi)胞(bao)(bao)或組織(zhi)的細(xi)胞(bao)(bao)核染色
● 貯(zhu)存：
-20℃避光(guang)保存，一(yi)年(nian)有(you)效。
● 操作步驟：
一.固定后的細胞(bao)樣品染色：
1. 貼壁細胞：
1.1.1 取(qu)潔凈(jing)(jing)蓋玻(bo)片在70%乙醇中浸(jin)泡5分鐘或更長(chang)時間，無菌(jun)超凈(jing)(jing)臺(tai)內吹干(gan)或用(yong)無菌(jun)的PBS洗滌三遍，再用(yong)細胞(bao)培(pei)養(yang)液洗滌一遍。將(jiang)蓋玻(bo)片置于六孔(kong)板(ban)內，種入細胞(bao)培(pei)養(yang)過夜，生長(chang)至50%-80%滿(man)度。
1.1.2刺激細胞發生凋亡(wang)后，吸(xi)盡培養液，加入0.5 ml固定液，固定10分鐘或(huo)更長時間(可4℃過夜)。
1.1.3去(qu)盡固定液(ye)，用PBS洗(xi)兩(liang)遍，每(mei)次(ci)3分鐘(zhong)，吸(xi)盡液(ye)體(ti)。洗(xi)滌(di)時(shi)宜用搖床或手動晃(huang)動。
1.1.4加入0.5 ml Hoechst 33258染色液(ye)，37℃避光染色10-15分(fen)鐘，手(shou)動晃動數次。
1.1.5去盡染色液(ye)，用PBS洗兩(liang)遍(bian)，每次3分鐘，吸盡液(ye)體。洗滌時宜用搖床或手(shou)動晃動。
1.1.6滴一滴抗熒光淬滅封片液于載(zai)玻(bo)(bo)片上(shang)，蓋上(shang)貼有細胞(bao)的(de)蓋玻(bo)(bo)片，讓(rang)細胞(bao)接觸封片液，盡量避免氣泡。
1.1.7 熒光顯(xian)微鏡使用紫外(wai)激發，可檢測(ce)到呈藍色的細胞核。激發波長(chang)350nm左右(you)，發射波長(chang)460nm左右(you)。
注：熒光染料(liao)都存(cun)在淬滅的問(wen)題(ti)，建議染色后盡快檢測。
2.懸浮(fu)細胞：
1.2.1 500 g（2400 rpm，下(xia)同）離心收集(ji)凋亡(wang)處理后細胞樣品于(yu)1.5 ml離心管內，加入0.5 ml固(gu)定(ding)液，緩緩懸起細胞，常溫固(gu)定(ding)10分鐘(zhong)或更長時間(可(ke)4℃過夜(ye))。
1.2.2離(li)心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，洗滌(di)期間手動晃動數次。
1.2.3 細胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動晃動數次(ci)。
1.2.4 離心收集沉(chen)淀(dian)，重懸于100 μl PBS中。
1.2.5 取5 μl抗熒光淬(cui)滅(mie)封片(pian)液于載玻片(pian)上(shang)，加入等體(ti)積步驟1.2.4染色后細胞重(zhong)懸液，蓋上(shang)一(yi)潔凈的蓋玻片(pian)，盡量避免氣泡。
1.2.6 熒光顯微鏡下紫(zi)外(wai)激(ji)發，可檢(jian)測到呈(cheng)藍色的(de)細胞核。激(ji)發波長(chang)350 nm左右，發射波長(chang)460 nm左右。
注：熒光染料都存(cun)在淬滅的問題(ti)，建議染色后盡快檢測。
二(er).活(huo)細胞(bao)染色：
2.1 加入適當量(liang)Hoechst33258染(ran)色液，必須充分覆蓋(gai)住待染(ran)色的(de)樣品(pin)，通常對于六孔(kong)板一個(ge)孔(kong)需加入1ml染(ran)色液，對于96孔(kong)板一個(ge)孔(kong)需加入100微升染(ran)色液。
2.2 在適宜于細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)的溫度下培(pei)養(yang)20-30分(fen)鐘。棄染色液，用(yong)PBS洗滌2-3次(ci)即可進行熒光檢(jian)測(ce)。細(xi)胞(bao)(bao)發生凋亡時(shi)，在熒光顯微鏡下觀(guan)察會看到凋亡細(xi)胞(bao)(bao)的細(xi)胞(bao)(bao)核呈(cheng)致密濃染，或呈(cheng)碎塊狀致密濃染。
三. 實驗示例:
操作流程： 胰酶消(xiao)化液(ye)消(xiao)化，計數2×106/ml；500 g 3 min收集1.3 ml 293細胞(bao)；細胞(bao)沉淀中加入1 ml卡諾固定(ding)(ding)液，常(chang)溫固定(ding)(ding)10 min；1×PBS漂洗(xi)兩次；細胞沉淀中加入200 μl Hoechst染色液（10 μg/ml）；37度避光染色10 min； 離心(xin)后(hou)細胞沉淀(dian)重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細(xi)胞(bao)懸液(ye)滴于載玻片(pian)上(shang)，加(jia)5 μl 抗熒(ying)光淬滅(mie)劑，封(feng)片觀察。