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植物原(yuan)生質體制(zhi)備(bei)試劑盒(he)                                        

●  產品組(zu)成：

● 產品簡介：

植(zhi)物(wu)原(yuan)生質體(ti)是(shi)(shi)指(zhi)脫去全部細(xi)胞(bao)(bao)壁由質膜包(bao)被的(de)(de)(de)(de)具有生命活力的(de)(de)(de)(de)裸露細(xi)胞(bao)(bao)。它具有細(xi)胞(bao)(bao)生命特征和(he)(he)全能型(xing)，是(shi)(shi)細(xi)胞(bao)(bao)無性系變異和(he)(he)突變體(ti)篩選(xuan)的(de)(de)(de)(de)重要來源，同時也是(shi)(shi)植(zhi)物(wu)遺傳工程(cheng)的(de)(de)(de)(de)理想受體(ti)和(he)(he)遺傳改良的(de)(de)(de)(de)理想材料。酶(mei)解法分離原(yuan)生質體(ti)是(shi)(shi)一個常用(yong)的(de)(de)(de)(de)技術，其原(yuan)理是(shi)(shi)植(zhi)物(wu)細(xi)胞(bao)(bao)壁主要由纖維(wei)(wei)素(su)(su)、半纖維(wei)(wei)素(su)(su)和(he)(he)果膠質組成，因而(er)使用(yong)纖維(wei)(wei)素(su)(su)酶(mei)、半纖維(wei)(wei)素(su)(su)酶(mei)、離析酶(mei)和(he)(he)果膠酶(mei)能降解細(xi)胞(bao)(bao)壁成分，去除細(xi)胞(bao)(bao)壁，即可得(de)到原(yuan)生質體(ti)。試劑盒配套(tao)的(de)(de)(de)(de)酶(mei)混(hun)合(he)物(wu)是(shi)(shi)纖維(wei)(wei)素(su)(su)酶(mei)R-10和(he)離析酶R-10的(de)(de)混(hun)合物，優(you)化(hua)的(de)(de)酶配比能很好(hao)(hao)地消(xiao)化(hua)植物細胞壁，提取到良好(hao)(hao)的(de)(de)植物原生質體。

按照每次使用5 ml酶消(xiao)(xiao)化體(ti)系(xi)計算(suan)，本試劑(ji)盒可(ke)用于20次酶消(xiao)(xiao)化反應(ying)。本試劑(ji)盒每個5 ml反應(ying)體(ti)系(xi)可(ke)處理(li)0.1 g左右的(de)擬南芥葉片(pian)(pian)(約10~15葉片(pian)(pian))，操作(zuo)較好的(de)情況(kuang)下每5 ml體(ti)系(xi)可(ke)獲得約50-70萬(wan)個原生質體(ti)(不同植物不同操作(zuo)會有一(yi)定的(de)差(cha)異)，可(ke)滿足約25-70個樣品的(de)原生質體(ti)質粒(li)轉染操作(zuo)(按照每樣1-2萬(wan)個細胞(bao)計算(suan))。

本試劑盒不(bu)含有原生質(zhi)體轉化(hua)試劑，需要轉化(hua)請參見植物原生質(zhi)體轉化(hua)試劑盒（RTU4092 ）。

● 貯(zhu)存、效期及運輸(shu)：

  按照標簽溫度保(bao)存，至少一年有效。-20℃貯存組分4℃存放3-4不會影響(xiang)使用效果。3-4天經常(chang)使用的情況，可(ke)以全部(bu)保存在4℃。

試劑盒常溫運輸。

● 使(shi)用說(shuo)明：

   需(xu)要準備的材料（試劑(ji)盒不提供）：

   平(ping)頭鑷子；一次性刀(dao)片；50 ml離(li)心管；1.5 ml離(li)心管；水(shui)浴鍋

一、原生質(zhi)體分(fen)離(li)：

即用(yong)型酶溶(rong)液配制

注：溶(rong)液I容易(yi)被(bei)微(wei)生物(wu)污染，使用時須嚴格按(an)照無菌操作規范進行或者適當分裝后使用。

55℃處理能滅活核酸(suan)酶(mei)和蛋白酶(mei)并促進酶(mei)的溶(rong)解；

即用型酶溶液現(xian)用現(xian)配(pei)，不建議配(pei)制后(hou)凍存后(hou)再使用；

溶解好(hao)的正(zheng)常(chang)酶溶液(ye)(ye)(ye)應為澄清棕黃(huang)色溶液(ye)(ye)(ye)，如使(shi)用純(chun)度不好(hao)的酶，溶液(ye)(ye)(ye)為不溶解的乳白色懸(xuan)濁液(ye)(ye)(ye)，不能(neng)使(shi)用。

1. 酶解：

取(qu)生長狀態良好(hao)(hao)的(de)(de)葉片切成(cheng)0.5-1 mm的(de)(de)小條(tiao)，按照0.1 克葉片（擬南芥約15-20個葉片）加5 ml即用型酶(mei)溶(rong)液(ye)的(de)(de)比例迅速將切割好(hao)(hao)的(de)(de)葉片小條(tiao)浸泡于酶(mei)溶(rong)液(ye)中，避光(guang)，無需震(zhen)蕩，常溫（20-25℃）酶(mei)解3小時(shi)，間歇混勻(yun)。

注：酶(mei)(mei)(mei)解(jie)時(shi)間(jian)與葉(xie)(xie)片(pian)種類，葉(xie)(xie)片(pian)生(sheng)(sheng)(sheng)長狀(zhuang)態(tai)有關，請根據實(shi)驗需要(yao)適當調整酶(mei)(mei)(mei)解(jie)時(shi)間(jian)。3小時(shi)為(wei)(wei)擬(ni)(ni)南(nan)芥葉(xie)(xie)片(pian)推薦(jian)的(de)酶(mei)(mei)(mei)解(jie)時(shi)間(jian)。如條(tiao)件允許(xu)，可(ke)以(yi)使用微型真(zhen)空(kong)泵常(chang)溫避光條(tiao)件下(xia)抽真(zhen)空(kong)30 min，以(yi)使酶(mei)(mei)(mei)溶液更(geng)好地進入細胞間(jian)隙。酶(mei)(mei)(mei)溶液變為(wei)(wei)綠(lv)色(se)表明有原(yuan)生(sheng)(sheng)(sheng)質(zhi)體(ti)已(yi)經有分離(li)，溶液為(wei)(wei)濃綠(lv)色(se)表明原(yuan)生(sheng)(sheng)(sheng)質(zhi)體(ti)已(yi)經大量分離(li)。擬(ni)(ni)南(nan)芥原(yuan)生(sheng)(sheng)(sheng)質(zhi)體(ti)大小約為(wei)(wei)30-50 μm，顯(xian)微鏡(jing)鏡(jing)檢后(hou)確定是否分離(li)。葉(xie)(xie)片(pian)原(yuan)生(sheng)(sheng)(sheng)質(zhi)體(ti)細胞顯(xian)微鏡(jing)下(xia)為(wei)(wei)綠(lv)色(se)圓球狀(zhuang)，葉(xie)(xie)綠(lv)體(ti)分散(san)在整個(ge)細胞內，說明狀(zhuang)態(tai)較好；如呈現不規則(ze)形狀(zhuang)，說明原(yuan)生(sheng)(sheng)(sheng)質(zhi)

體破(po)碎(sui)或即將破(po)碎(sui)。

 2. 漂(piao)洗：

         取適量溶(rong)液(ye)II-漂洗溶(rong)液(ye)（5×），用超純水稀釋(shi)為1×漂洗溶(rong)液(ye)。

酶解后加入(ru)(ru)等(deng)體(ti)積的(de)1×漂(piao)洗(xi)溶液(ye)，如使用5 ml酶解體(ti)系，加入(ru)(ru)5 ml 1×漂(piao)洗(xi)溶液(ye)，輕柔混勻。

3. 過濾：

用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶(rong)液(ye)(ye)，去除(chu)未消化的葉片，用5-10 ml 1×漂(piao)洗(xi)溶(rong)液(ye)(ye)沖洗(xi)酶(mei)解器皿和未消化的葉片1-2次，將所有的液(ye)(ye)體收到50 ml離心管(guan)中。

4. 第一次收集：

濾出液100g常溫離心 2分鐘，盡量去除上(shang)清(qing)。

注(zhu)：為了避免(mian)原生質(zhi)體(ti)離(li)心(xin)時(shi)貼在(zai)管(guan)壁(bi)，建議(yi)整(zheng)個實驗過程使用水平轉頭；離(li)心(xin)時(shi)，可調低離(li)心(xin)機的升速和(he)降(jiang)(jiang)速。升速過快，原生質(zhi)體(ti)可能離(li)到管(guan)壁(bi)上；降(jiang)(jiang)速過快，可能導(dao)致(zhi)管(guan)底原生質(zhi)體(ti)懸起。建議(yi)升速和(he)降(jiang)(jiang)速分(fen)別(bie)都使用3。

5. 第二次收集：

加入2-5 ml 1×漂洗溶液，用剪尖(jian)的藍吸頭重懸原(yuan)生(sheng)質(zhi)體，冰(bing)浴30分鐘(zhong)，原(yuan)生(sheng)質(zhi)體在重力

作用下可以(yi)沉降到離心管(guan)底部，盡量(liang)吸(xi)除上清，收集原(yuan)生(sheng)質體。(如(ru)果發現原(yuan)生(sheng)質體沉降的速度比較(jiao)慢或者得(de)率(lv)比較(jiao)低(di)，也可以(yi)考慮(lv)常溫100 g離心1-2 min收集原(yuan)生(sheng)質體)。

6. 重懸(xuan)：

小心(xin)去(qu)除(chu)上清溶液(ye)，不要觸動原生(sheng)質體(ti)沉淀(dian)，沉淀(dian)用剪尖的藍吸(xi)頭重懸于1 ml溶液(ye)III中即為(wei)原生(sheng)質體(ti)溶液(ye)。（可以用血球計數板計數，根據原生(sheng)質體(ti)數量調(diao)整(zheng)溶液(ye)III的加入體(ti)積，使得原生(sheng)質體(ti)密度(du)為(wei)2×10⁵/ml或(huo)更高）。

注(zhu)：制(zhi)備好的原生質體(ti)可以在(zai)4oC或冰浴(yu)保存至少24 h。

二、實驗示例(li)：

                使用植物原生質體制備試(shi)劑(ji)盒轉染擬(ni)南(nan)芥(jie)原生質體的效(xiao)果(guo)圖。

實驗(yan)步驟(zou)：稱取0.48 g轉(zhuan)化(hua)(hua)試(shi)(shi)劑(ji)于2 ml 離心(xin)(xin)管中，加(jia)入轉(zhuan)化(hua)(hua)試(shi)(shi)劑(ji)溶(rong)解液(ye)后，顛(dian)倒(dao)混勻(yun)，蒸(zheng)餾(liu)水定(ding)容至2 ml，使轉(zhuan)化(hua)(hua)試(shi)(shi)劑(ji)充(chong)分溶(rong)解后備用。在2 ml的(de)圓底離心(xin)(xin)管中加(jia)入10 μl（20 μg）EGFP質(zhi)粒 (植(zhi)物用綠色熒光蛋白)，加(jia)入100 μl制(zhi)備好的(de)原(yuan)(yuan)生質(zhi)體，輕柔(rou)混勻(yun)后加(jia)入110 μl當日配制(zhi)好的(de)轉(zhuan)化(hua)(hua)試(shi)(shi)劑(ji)溶(rong)液(ye)，輕柔(rou)混勻(yun)，常(chang)溫(wen)靜置5 min后加(jia)入440 μl 1×漂(piao)洗(xi)溶(rong)液(ye)終(zhong)止(zhi)轉(zhuan)化(hua)(hua)，輕輕顛(dian)倒(dao)混勻(yun)，常(chang)溫(wen)100 g離心(xin)(xin)1 min，去(qu)(qu)除(chu)上清，再加(jia)入0.5 ml 1×漂(piao)洗(xi)溶(rong)液(ye)，輕柔(rou)重(zhong)懸原(yuan)(yuan)生質(zhi)體，常(chang)溫(wen)100 g離心(xin)(xin)1 min后，盡(jin)量去(qu)(qu)除(chu)上清，收集原(yuan)(yuan)生質(zhi)體。加(jia)入1 ml溶(rong)液(ye)V，小心(xin)(xin)重(zhong)懸原(yuan)(yuan)生質(zhi)體后水平放置25℃培(pei)養過夜(約16h)，次日于熒光顯微鏡(jing)下檢(jian)測EGFP熒光信號。

植物原生質體提取試劑盒發表文章列表（15篇）

1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a -expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.

實驗植物：小麥

Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu.

Journal: J Plant Physiology 2019

Institution：  College of Life Sciences, Northeast Agricultural University

Paper link：

2. [IF=5.36] Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X infection. 

實驗植物：煙草

Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,  Jianping Chen and Fei Yan

Journal: Journal of Experimental Botany, 2020，Vol.71, No. 6,2142–2156, 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：

3. [IF=7.228]  Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection

實驗植物：煙草

Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu, Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng, Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan

Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30 July 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：

4. [IF=5.64]  A Novel, Small Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger Plant Cell Death

實驗植物：水稻

Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin, Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng

Journal: Fronties in Microbiology August 2021 | Volume 12 | Article 684923 

Institution：Sichuan Agricultural University

Paper link：

5. [IF=9.8]  Synthesis of flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in DNA methylation during peach fruit ripening

實驗植物：煙草

Author: Chunyan Wei, Hongru Liu, Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang

Journal: Plant Biotechnology Journal (2021) 19, pp. 2082–2096 

Institution：Laboratory of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University

Paper link：

6. [2020IF=1.04]  EoPHR2, a Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides

實驗植物：擬南芥

Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2, Shenghao Zhou3, Haoran Wang

Journal: Phyton Vol.91, No.3, 2022, pp.651-665

Institution： Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences

Paper link：

7. [2021IF=3.2]  Establishment and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus pluvia

實驗材料：雨生紅球藻 Haematococcus pluvia

Author: Chunli Guo，Muhammad Anwar， Rui Mei，Xinyi Li， Di Zhao，Yanan Jiang， Jieyi Zhuang， Chen Liu，Chaogang Wang， Zhangli Hu

Journal: Journal of Applied Phycology. Published online 07 March 2022

Institution：College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University

Paper link： 

8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in Nelumbo nucifera Gaertn

實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn

Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang, Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding

Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.

Institution：College of Life Sciences, Guizhou University，College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link： //www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901

9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association analysis reveals a novel pathway mediated by a dual-TIR domainprotein for pathogen resistance in cotton

實驗材料：棉花

Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang, Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang

Journal: Genome Biology  (2023) 24:111

Institution：Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences

Paper link： //doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9

10. [2022 IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L

實驗材料：Rose 玫瑰

Author: Chen Yeqing ,Lu  Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo ,Yuan Guozhen ,Sun  Jingjing ,Liu  Jinyi ,Wang Changquan

Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link： 

11. [2022 IF=17.4] Functionalized carbon nano-enabled plant ROS signal engineering for growth / defense balance

實驗材料：擬南芥

Author: Zhijiang Guo , Qiong Chen , Taibo Liang , Baoyuan Zhou , Suhua Huang , Xiufeng Cao, Xiuli Wang , Zaisong Ding, Jiangping Tu

Journal: Nano Today 53 (2023) 102045

Institution：School of Materials Science and Engineering, Zhejiang University

Paper link：

12. [2022 IF=13.8] Unveiling the mechanism of broad-spectrum blast resistance in rice: The collaborative role of transcription factor OsGRAS30 and histone deacetylase OsHDAC1

實驗材料：水稻

Author: Jiaqi Hou, Huangzhuo Xiao, Peng Yao, Xiaoci Ma, Qipeng Shi, Jin Yang, Haoli Hou and Lijia Li

Journal: Plant Biotechnology Journal (2024), pp. 1–17

Institution：State Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link：

13. [2022 IF=7.2] NnSnRK1-NnATG1-mediated autophagic cell death governs flower bud abortion in shaded lotus

實驗材料：荷花

Author: Xiehongsheng Li, Yingchun Xu, Zongyao Wei, Jiaying Kuang, Mingzhao She, Yanjie Wang and Qijiang Jin

Journal: Plant J (2024) 117, 979–998

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link：

14. [2022 IF=7.5] The dynamic TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90 complex modulates NLR-protein-mediated antiviral immunity in wheat.

實驗材料：小麥

Author: Haichao Hu, Tianye Zhang, Jinnan Wang, Jun Guo, Yaoyao Jiang, Qiansheng Liao, Lu Chen, Qisen Lu,Peng Liu, Kaili Zhong, Jiaqian Liu, Jianping Chen, Jian Yang

Journal: Cell Reports 43, 114765, October 22, 2024

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University

Paper link：

15. [2023 IF=14.3] Natural SNP Variation in GbOSM1 Promotor Enhances Verticillium Wilt Resistance in Cotton.

實驗材料：棉花

Author: Guilin Wang, Dayong Zhang, Haitang Wang, Jinmin Kong, Zhiguo Chen, Chaofeng Ruan, Chaoyang Deng, Qihang Zheng, Zhan Guo, Hanqiao Liu, Weixi Li, Xinyu Wang,and Wangzhen Guo

Journal: Advanced Science 2024, 2406522

Institution：Nanjing Agricultural University

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