Tricine多肽電泳參考文獻
何時使(shi)用Tricine-SDS-PAGE檢測小分子肽?
如果你感興趣的蛋白小于20KD,你(ni)就要使用Tricine-SDS-PAG系統來分(fen)離小肽了。Tricine-SDS-PAGE系(xi)統是可(ke)以分離1-100KD的蛋白質(zhi)。此系統(tong)最適合(he)分離低于30KD的蛋白質。
相(xiang)關產品:超低分子量蛋白電泳(yong)試劑盒(貨號:RTD6120)
Tricine-SDS-PAGE與傳統SDS-PAGE的區別:
1 分離膠中更(geng)高的Tris濃(nong)度:終濃(nong)度為0.75M;普通(tong)SDS-PAGE為0.375M
2 分離膠(jiao)和濃縮膠(jiao)中(zhong)的pH都是8.45
3 分離膠(jiao)中更高的交(jiao)聯度(C)-5%,普(pu)通的SDS-PAGE為C一(yi)般為3.3%。
小肽的電泳:
1 關于陰(yin)極緩(huan)沖液和(he)陽極緩沖液:
Tricine-SDS-PAGE系統(tong)不同于常規的SDS-PAGE,使用兩種(zhong)緩沖(chong)液電泳。電泳槽內(nei)槽是1×陰極緩沖液,含(han)有(you)Tricine和SDS。外(wai)槽是(shi)1×陽極緩沖(chong)液,是(shi)0.2M Tris。由于電泳(yong)(yong)槽(cao)(cao)(cao)內外槽(cao)(cao)(cao)緩沖(chong)(chong)液(ye)不(bu)一樣(yang),電泳(yong)(yong)前要檢測(ce)電泳(yong)(yong)槽(cao)(cao)(cao)是否漏(lou)(lou)液(ye),如果(guo)漏(lou)(lou)液(ye)的(de)話將導(dao)致內外槽(cao)(cao)(cao)緩沖(chong)(chong)液(ye)混合,導(dao)致電泳(yong)(yong)結果(guo)不(bu)好。如果(guo)發現內槽(cao)(cao)(cao)緩沖(chong)(chong)液(ye)漏(lou)(lou)液(ye),可以(yi)將外槽(cao)(cao)(cao)緩沖(chong)(chong)液(ye)加滿到和內槽(cao)(cao)(cao)緩沖(chong)(chong)液(ye)齊平。
2 關于電泳(yong)時的電壓:
濃縮(suo)膠一般用穩壓80-100V,如果使用新鮮的緩沖液,這時的電流應該在20mA左右(you),如果電流太(tai)小,請檢查(cha)緩沖(chong)液以及電泳設備是否有(you)問題。當指示前沿至濃縮膠和分離膠交(jiao)界時,電壓可(ke)以調高到120-150V。整個電泳時間約(yue)需2-3小時。
3 關于電泳的指(zhi)示前沿:
由(you)于(yu)溴酚藍在Tricine-SDS-PAGE系統中泳(yong)動很(hen)快,很(hen)快就跑到(dao)緩沖(chong)液中去了。超(chao)低(di)分子量(liang)蛋白Marker和2×Tricine 上(shang)樣緩沖液中(zhong)的(de)指(zhi)示前沿(yan)是考馬斯亮(liang)藍G-250。電泳中只要指示(shi)前沿(yan)跑不丟,小肽(tai)就(jiu)不會跑丟。然而,考馬斯亮藍(lan)G-250作為指示前沿(yan)的缺點是在(zai)分離(li)膠中比較彌散(san)。如(ru)果電泳時(shi)間較短,染(ran)色時(shi)會(hui)遮擋3KD左右(you)的小肽。
4 小肽的(de)染色:
由于小肽還有較少(shao)的氨基酸,染色時結合的染料就少(shao),導致染色靈敏度比較低。上樣時要加(jia)大(da)上樣量。另外,低于5KD的小提(ti)容(rong)易從PAGE膠(jiao)上脫離,染色前(qian)最好有個固定(ding)步驟(0.5%戊(wu)二(er)醛(quan),30%乙醇)。為了更好的染(ran)色小肽,可以(yi)選擇FastBlue蛋白染(ran)色液(Cat No:RTD6202),該(gai)產品(pin)除(chu)具有染(ran)(ran)色(se)快,無毒(du),靈敏性(xing)高等(deng)特(te)點外,還能對小肽(tai)在染(ran)(ran)色(se)中(zhong)起(qi)到固(gu)定作用,不至于(yu)小肽(tai)在染(ran)(ran)色(se)和脫色(se)中(zhong)從(cong)凝膠中(zhong)脫離,是常規染(ran)(ran)色(se)液的理想替代品(pin)。
小肽的轉(zhuan)膜/Western Blot實驗
由(you)于小(xiao)肽比較(jiao)小(xiao),轉膜時要注意小(xiao)肽非常容(rong)易透過PVDF膜。兩種方法(fa)可以解(jie)決(jue)這(zhe)一問(wen)題:兩張PVDF膜重疊在一起;縮短轉膜時(shi)間(半(ban)干法轉移(yi),200mA 15-20分(fen)鐘(zhong)就(jiu)可(ke)以了(le))。轉膜使用(yong)0.22 μm的PVDF膜。濕轉(轉膜緩沖液加20%甲(jia)醇,不加或少加SDS,200mA 30-35分鐘)。
小肽電泳文獻:
1 Schagger, H. & von Jagow, G. Tricine–sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1–100 kDalton. Anal. Biochem. 166, 368–379 (1987). PDF下載
最原(yuan)始小肽(tai)電(dian)泳的文(wen)獻。
2 Schagger, H. Tricine–SDS-PAGE. Nature Protocols. 1,16-23,2006 PDF下載
87年的作者Schagger在Nature Protocols 開刊文章(zhang),寫的精細,值得推薦。
3 兩篇國內文獻,主要討論尿素的作用。
多肽的電泳分離 2004
有效分離1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法 2004