Blue/Clear 非變性凝膠電(dian)泳試劑盒
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit Ver.730852
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貨(huo)號
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名(ming)稱(cheng)
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包(bao)裝
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RTD6139-0312
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Blue/Clear非變性凝膠電泳試劑盒(U型(xing)板3-12%預(yu)制膠，通(tong)用型)
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10 次
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RTD6139-0416
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Blue/Clear非(fei)變性凝(ning)膠電泳試劑盒(U型板4-16%預制膠，通用型)
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10 次(ci)
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● 貨品內容(rong)：
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組(zu)份(fen)
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貨號
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名稱
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規格
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保(bao)存(cun)
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1
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RTD6138-0312
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3-12%
RealPAGE Native BN/CN 預制膠(jiao)
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10板
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4℃
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RTD6138-0416
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4-16%
RealPAGE Native BN/CN 預制膠
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10板
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4℃
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2
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BC500P
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10×BN/CN PAGE電(dian)泳(yong)緩(huan)沖液（干粉(fen)）
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500 ml
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RT
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3
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PL114
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bai)上樣緩(huan)沖液
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1 ml
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-20℃
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4
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BC270
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2% G-250染料(liao)（電泳(yong)用(yong)）
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20 ml
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RT
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5
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BC260
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5% G-250染料（上樣(yang)用(yong)）
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1 ml
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4℃
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6
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說(shuo)明書(shu)
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一份
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● 產品(pin)簡介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從生物樣品（質膜，胞漿等）中非變性分離蛋白質復合物的電泳技術。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)復(fu)合體從細胞(bao)膜中以近似天然(ran)的狀(zhuang)態分(fen)離(li)出來(lai)，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考(kao)馬(ma)斯亮藍(lan) G-250 代替 SDS與蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)結合而(er)使其(qi)帶(dai)負(fu)電(dian)(dian)荷(he)，根據蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)分(fen)子量不同在(zai) PAGE膠中得到分(fen)離(li)；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電(dian)(dian)泳緩沖(chong)液(ye)中不加入任(ren)何染(ran)料，電(dian)(dian)泳中始終(zhong)保持蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的天然(ran)電(dian)(dian)荷(he)和活性狀(zhuang)態，然(ran)而(er)，其(qi)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的分(fen)辨(bian)率(lv)要(yao)低(di)于(yu)Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由(you)于(yu)考(kao)馬(ma)斯亮藍(lan)G-250存(cun)在(zai)，使蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)都覆(fu)蓋上負(fu)電(dian)(dian)荷(he)，可以分(fen)離(li)堿性蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)（pI＞7）；而(er)CN-PAGE只適合于(yu)酸性蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)（pI＜7）的分(fen)離(li)。
本產品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分，方便使用。可以用于分離分子量在
60
kD-1000 kD 的蛋白復合體，樣品可以來于胞漿、細胞總裂解液、細胞膜、線粒體膜和葉綠體膜等。電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交、SDS-PAGE電泳、蛋白純化、蛋白活性檢測等分析實驗，也可直接用于電洗脫制備蛋白。
● 運輸和貯(zhu)存：
本產品常(chang)溫(wen)運(yun)輸；組份(fen)按照標簽溫度(du)貯存(cun)；有效期一年。
● 使用說明：
1. 樣品制備：
該試劑盒不含樣品制備的相關試劑，根據樣品種類選擇不同提取方法。植物類囊體BN樣品制備可以選擇植物類囊體膜提取試劑盒（貨號:RTU5002）；動物總蛋白BN樣品制備可以選擇動(dong)(dong)物(wu)(wu)胞(bao)漿活性蛋(dan)白提取(qu)試劑盒(he)(貨號:RTD8106)；動(dong)(dong)物(wu)(wu)膜(mo)蛋(dan)白BN樣(yang)品(pin)制備可以(yi)選擇動(dong)(dong)物(wu)(wu)膜(mo)蛋(dan)白提取(qu)試劑盒(he)（貨號:RTD8111,RTD8112）；動(dong)(dong)物(wu)(wu)線粒體(ti)BN樣(yang)品(pin)制備可以(yi)選擇動(dong)(dong)物(wu)(wu)線粒體(ti)提取(qu)試劑盒(he)（貨號:RTD8115和RTD8116)。
2. 電(dian)泳(yong)：
2.1 拆開預制膠包裝，將預制膠安裝在合(he)適的(de)電泳槽中。
注(zhu)：伯樂Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天(tian)能VE-180，六(liu)一(yi)24K系(xi)列電(dian)泳槽(cao)請確保(bao)密封條的安裝方向（下(xia)圖）。
六一(yi)其他系(xi)列(lie)，君意(yi)東(dong)方JY-SCZ2/4，百(bai)晶BG-verMINI等電泳槽可以直接使用預(yu)制膠。
不兼容Thermol系列電泳槽。
2.2 準備電(dian)泳緩沖液：
將10×BN/CN PAGE電(dian)(dian)泳緩沖液（干粉）溶(rong)于500 ml滅菌水中，徹(che)底溶(rong)解(jie)，測定pH應為(wei)7.0左右，不(bu)要調(diao)節(jie)pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電(dian)(dian)泳緩沖液。
2.2.1 CN-PAGE電(dian)泳：
陽極(ji)緩(huan)沖液(ye)和陰(yin)極(ji)緩沖液(ye)均直接使用1×BN/CN PAGE電泳(yong)緩沖液(ye)進行電泳(yong)。
2.2.2 BN-PAGE電泳(yong)：
陽極緩沖(chong)液使用(yong)1×BN/CN PAGE電泳緩沖(chong)液，陰極緩沖(chong)液按(an)照下(xia)表配制：
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1×藍色陰極緩(huan)沖(chong)液
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150 ml
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10×BN/CN PAGE電泳(yong)緩沖(chong)液
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15 ml
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2% G-250 染料(liao)（電泳用）
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1.5 ml
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超純水
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定容至150 ml
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2.3準備樣品：
2.3.1 CN-PAGE電泳(yong)：
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總體(ti)積
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10 μl
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蛋白樣品
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋(dan)白上樣緩沖液
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2.5 μl
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超純水
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補(bu)至(zhi)10 μl
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不(bu)要加熱(re)
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2.3.2 BN-PAGE電泳：
2.3.2.1 植物類囊體膜蛋白電泳：
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總體(ti)積
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10
μl
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含去垢劑樣品*
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植(zhi)物類囊體膜蛋白(bai)樣品
（2%DDM增溶(rong)）
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bai)上(shang)樣緩沖液
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2.5 μl
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5%
G-250染料(liao)（蛋白(bai)上(shang)樣）
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1 μl
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超純水
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補至10 μl
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不要加熱
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*植物類囊體膜蛋白電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
植物類囊體樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/4。例如樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為2%，則需要G-250終濃度為0.5%。10 μl蛋白樣品中需要加5%
G-250染料1 μl。
2.3.2.2 動物線粒體BN樣品電泳：
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總體(ti)積
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10
μl
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含去垢劑樣品*
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動(dong)物線粒體(ti)BN樣品(pin)
（1%DDM增溶(rong)）
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋(dan)白(bai)上樣緩沖液(ye)
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2.5 μl
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5%
G-250染(ran)料（蛋白(bai)上樣）
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0.25 μl
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超純(chun)水
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補至10 μl
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不要加(jia)熱(re)
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*動物線粒體BN樣品電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
動物線粒體BN樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/8。例如樣品中DDM終濃度為1%，則需要G-250終濃度為0.125%。10
μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料0.25
μl。
2.4電泳過程；
2.4.1 CN-PAGE電泳(yong)：
電(dian)(dian)(dian)泳(yong)內(nei)外槽(cao)均使(shi)用(yong)1×BN/CN PAGE電(dian)(dian)(dian)泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)。在電(dian)(dian)(dian)泳(yong)槽(cao)的(de)內(nei)槽(cao)內(nei)加入1×BN/CN PAGE電(dian)(dian)(dian)泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)(讓(rang)電(dian)(dian)(dian)泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)漫過(guo)加樣孔(kong))，輕(qing)輕(qing)撥出(chu)預(yu)制膠梳子，用(yong)1ml吸頭沖(chong)洗加樣孔(kong)3次，隨后在電(dian)(dian)(dian)泳(yong)槽(cao)外槽(cao)加入適量的(de)1×BN/CN PAGE電(dian)(dian)(dian)泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)。
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CN-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結束電(dian)流
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電泳時間
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120V
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10-15mA/板(ban)膠
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4-10mA/板膠
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50+min
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注：冰浴電泳
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2.4.2 BN-PAGE電(dian)泳(yong)：
BN-PAGE電(dian)泳外槽(cao)使(shi)用1×BN/CN電(dian)泳緩沖液；內槽(cao)開始電(dian)泳使(shi)用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電泳，等待電泳指示前沿(yan)到達凝膠1/3處時，將電泳緩沖(chong)液更換(huan)為1×BN/CN電泳緩沖(chong)液，繼續后(hou)續電泳，因為過多染料會(hui)影響蛋白在凝膠中的遷移以及蛋白后(hou)續的轉膜實驗。
BN-PAGE電泳條件（一板膠）
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恒電(dian)壓
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起始電流
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電泳時間
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緩沖液
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120 V
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8-15 mA
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20-25
min
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1×藍色陰極(ji)緩沖液(ye)
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冰浴電泳
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;指示前沿至(zhi)凝膠頂部三分之(zhi)二(er)處，更換內槽緩沖液為1×BN/CN 電泳緩沖液
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恒電壓(ya)
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繼續電泳時間
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結束(shu)電流(liu)
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緩沖液
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120 V
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45 min
+
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3-5 mA
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1×BN/CN電(dian)泳緩沖液(ye)
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冰(bing)浴電泳
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3. 轉膜(mo)：
BN-PAGE轉(zhuan)(zhuan)膜必須用(yong)PVDF膜，不能用(yong)NC膜，因為NC膜與G-250結(jie)合非常(chang)緊密，不易去除。轉(zhuan)(zhuan)膜后PVDF膜上的藍色染(ran)料可以(yi)用(yong)無水甲醇漂(piao)洗去除。轉(zhuan)(zhuan)膜緩沖(chong)液推薦(jian)使用(yong)10×BN轉(zhuan)(zhuan)膜緩沖(chong)液（貨號：BC600P）。
4. 染色：
4.1 將電泳后(hou)的PAGE膠取下(xia)放入(ru)塑料(liao)容器中，加入(ru)適量FastBlue蛋白染色液(ye)或常(chang)規(gui)考馬斯(si)亮藍染(ran)色液（以剛(gang)剛(gang)覆蓋過膠面(mian)為適），條帶(dai)1-2分鐘即可見。
4.2 搖床(chuang)常(chang)溫搖動10-15分鐘至條帶(dai)清晰可見。
4.3 加入適量蒸(zheng)餾水脫(tuo)色(se)，期(qi)間(jian)更換1-2次蒸(zheng)餾水，搖床常溫搖動10-15分(fen)鐘至背景(jing)干(gan)凈。
4.4 觀察保存結果。
5. 實驗示(shi)例：
BN-PAGE 3-12% Precast Gel
穩壓120V 1.5 h 1×BN/CN電(dian)泳緩沖液 冰浴(yu)電(dian)泳
BN-PAGE 4-16% Precast Gel
恒壓(ya) 120V 2 h 1×BN/CN電泳緩(huan)沖液 冰浴電泳
K562 膜蛋白BN-WB檢測
樣品：膜蛋白提取樣品用2%DIG和1%DM增溶（ 貨號：RTD8111，動物膜蛋白提取試劑盒(細胞)） ，
胞漿蛋白CY做對照
電泳：3-12% BN預制膠（貨號：RTD6138-0312），穩壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上沿2/3處，
更換為無色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，電泳時間共83分鐘
膠預處理：膠浸泡于buffer中（12.5mM Tris，2%SDS，20%甘油，50mM DTT pH6.8），微波煮沸20秒，37度15min后轉膜
轉膜：0.45μm PVDF膜，10×BN轉膜緩沖液（貨號：BC600P）稀釋為1×BN轉膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA 2小時，未冰浴。
轉膜效果檢測：膜用麗春紅染色液染色（貨號：RTD6301）有可見條帶，膠用FastBlue蛋白染色液染色
（貨號：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉膜成功。膜用無水甲醇清洗5分鐘去除膜上藍色殘余。
封閉：Western快速封閉液（貨號：WR5020） RT 封閉10 分鐘；
圖1 一抗：兔單抗GAPDH 1:10000 RT 60min；羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光6秒
圖2 膜使用Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）（貨號：WS1200）37度15min，快封10分鐘，
一抗：兔Na-K ATPase 1:5000 RT 60min，羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光1秒
Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(RTD6139/RTD6138)
使用該產品發表部分文章列表：
1. [2021 IF=10.15] SlRIP1b
is a global organellar RNA editing factor, required for normal fruit
development in tomato plants
Author: Jinyan Li, Keru
Wang, Yongfang Yang, Yao Lu, Kaicheng Cui, Yajing Ji, Liqun Ma, Ke Cheng, Oren
Ostersetzer-Biran, Feng Li, Guiqin Qu, Benzhong Zhu, Daqi Fu, Yunbo Luo,
Hongliang Zhu
Journal: New
Phytologist 2023，Volume237, Issue4，February 2023，Pages 1188-1203
Institution： China Agricultural University
Paper link：
2.
[2022 IF=8.0] Tektin bundle interacting protein, TEKTIP1,
functions to stabilize the tektin bundle and axoneme in mouse sperm flagella
Author: Xinyan Geng,Huijuan Jin,
Lan Xia.Binbin Wang,Suren Chen
Journal: Cellular and Molecular Life Sciences (2024)
81:118
Institution: Beijing
Normal University
Paper link：
3.
[2022 IF2.6] What are the main proteins in the hemolymph
of Haemaphysalis flava ticks?
Author: Dan Li , Lei Liu , Zi-ling Liu
, Yuan Tian , Xin Gao，Tian-yin Cheng
Journal: Frontiers in Veterinary Science Published 17
July 2024
Institution: Hunan
Agricultural University
Paper link：