Blue/Clear 非變性凝膠(jiao)電泳試劑盒(he)
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit
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貨號
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名稱(cheng)
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包裝
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RTD6139-0312
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Blue/Clear非變性凝膠電泳試劑盒(U型板3-12%預制膠(jiao)，通(tong)用型(xing))
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10 次
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RTD6139-0416
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Blue/Clear非(fei)變性凝膠電(dian)泳試劑盒(U型(xing)板4-16%預制(zhi)膠，通用型)
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10 次
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● 貨品內容(rong)：
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組份
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貨號(hao)
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名稱
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規格
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保存
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1
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RTD6138-0312
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3-12% RealPAGE Native BN/CN 預制膠(jiao)
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10板
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4℃
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RTD6138-0416
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4-16% RealPAGE Native BN/CN 預制(zhi)膠
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10板
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4℃
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2
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BC500P
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10×BN/CN PAGE電泳緩沖(chong)液(ye)（干粉(fen)）
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500 ml
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RT
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3
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PL114
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bai)上樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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4
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BC270
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2% G-250染料（電泳用(yong)）
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20 ml
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RT
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5
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BC260
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5% G-250染料（上樣用）
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1 ml
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4℃
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6
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說(shuo)明書
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一份
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● 產品簡介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從生物樣品（質膜，胞漿等）中非變性分離蛋白質復合物的電泳技術。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)復合體從細胞膜中(zhong)以(yi)近似天然(ran)的狀(zhuang)態分離出(chu)來，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是(shi)用(yong)考馬斯(si)亮藍(lan) G-250 代(dai)替 SDS與(yu)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)結合而(er)使其帶負電(dian)(dian)荷，根(gen)據蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)分子量不同在 PAGE膠(jiao)中(zhong)得到分離；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是(shi)電(dian)(dian)泳緩沖液(ye)中(zhong)不加(jia)入(ru)任何染料，電(dian)(dian)泳中(zhong)始終保(bao)持蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的天然(ran)電(dian)(dian)荷和活(huo)性狀(zhuang)態，然(ran)而(er)，其蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的分辨(bian)率要低(di)于Blue Native PAGE。另(ling)外，BN-PAGE由(you)于考馬斯(si)亮藍(lan)G-250存在，使蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)都(dou)覆蓋上負電(dian)(dian)荷，可以(yi)分離堿性蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)（pI＞7）；而(er)CN-PAGE只(zhi)適合于酸性蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)（pI＜7）的分離。
本產品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分(fen)，方(fang)便使用(yong)。可以用(yong)于分(fen)離分(fen)子量在 60 kD-1000 kD 的蛋(dan)(dan)白復(fu)合體，樣(yang)品(pin)可(ke)以來(lai)于胞(bao)漿、細(xi)胞(bao)總裂(lie)解(jie)液、細(xi)胞(bao)膜、線粒體膜和(he)葉綠體膜等(deng)。電(dian)(dian)泳后可(ke)直接用于考染、銀染、Western 雜交、SDS-PAGE電(dian)(dian)泳、蛋(dan)(dan)白純化、蛋(dan)(dan)白活性檢(jian)測等(deng)分(fen)析實驗，也可(ke)直接用于電(dian)(dian)洗脫制(zhi)備蛋(dan)(dan)白。
● 運輸(shu)和貯存：
本(ben)產品常溫運輸(shu)；組(zu)份按照(zhao)標簽溫度(du)貯存；有效期一年(nian)。
● 使(shi)用說(shuo)明(ming)：
1. 樣品制備：
該試劑盒不含樣品制備的相關試劑，根據樣品種類選擇不同提取方法。植物類囊體BN樣品制備可以選擇植物類囊體膜提取試劑盒（貨號:RTU5002）；動物總蛋白BN樣品制備可以選擇動(dong)物(wu)胞漿活(huo)性(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)提(ti)取(qu)(qu)試(shi)劑(ji)盒(he)(he)(貨(huo)號(hao):RTD8106)；動(dong)物(wu)膜(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)BN樣品制備(bei)可(ke)以(yi)選(xuan)擇(ze)動(dong)物(wu)膜(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)提(ti)取(qu)(qu)試(shi)劑(ji)盒(he)(he)（貨(huo)號(hao):RTD8111,RTD8112）；動(dong)物(wu)線(xian)粒體BN樣品制備(bei)可(ke)以(yi)選(xuan)擇(ze)動(dong)物(wu)線(xian)粒體提(ti)取(qu)(qu)試(shi)劑(ji)盒(he)(he)（貨(huo)號(hao):RTD8115和RTD8116)。
2. 電泳：
2.1 拆開預制膠包裝，將預制膠安裝在合適的電泳槽中。
注：伯樂Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列電泳槽請確保密封條的安裝方向（下圖）。
六一其他系列，君意東方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等電泳槽可以直接使用預制膠。
不兼容Thermol系列電泳槽。
2.2 準備電泳緩沖液：
將10×BN/CN PAGE電泳緩沖液（干粉）溶于500 ml滅菌水中，徹底溶解，測定pH應為7.0左右，不要調節pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
2.2.1 CN-PAGE電泳：
陽極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液進行電泳。
2.2.2 BN-PAGE電泳：
陽極緩沖液使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，陰極緩沖液按照下表配制：
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1×藍(lan)色陰(yin)極緩(huan)沖(chong)液
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150 ml
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10×BN/CN PAGE電泳緩沖液(ye)
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15 ml
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2% G-250 染料(liao)（電泳用）
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1.5 ml
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超純(chun)水
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定容至150 ml
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2.3準備樣品：
2.3.1 CN-PAGE電泳：
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總(zong)體積
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10 μl
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蛋白樣品
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋(dan)白上樣(yang)緩沖液
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2.5 μl
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超純水
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補至10 μl
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不要加熱
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2.3.2 BN-PAGE電泳：
2.3.2.1 植物類囊體膜蛋白電泳：
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總體積
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10 μl
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含(han)去垢(gou)劑樣品*
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植(zhi)物類囊體膜(mo)蛋(dan)白樣品
（2%DDM增溶）
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋(dan)白上樣緩沖(chong)液(ye)
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2.5 μl
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5% G-250染料（蛋白上樣）
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1 μl
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超純水(shui)
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補至10 μl
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不要(yao)加(jia)熱
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*植物類囊體膜蛋白電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
植物類囊體樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/4。例如樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為2%，則需要G-250終濃度為0.5%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料1 μl。
2.3.2.2 動物線粒體BN樣品電泳：
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總體積
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10 μl
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含去垢劑樣品*
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動物(wu)線粒體BN樣品
（1%DDM增溶）
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上(shang)樣緩沖液
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2.5 μl
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5% G-250染料（蛋(dan)白上樣）
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0.25 μl
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超純水
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補至10 μl
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不要(yao)加熱
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*動物線粒體BN樣品電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
動物線粒體BN樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/8。例如樣品中DDM終濃度為1%，則需要G-250終濃度為0.125%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
2.4電泳過程；
2.4.1 CN-PAGE電泳：
電泳內外槽均使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。在電泳槽的內槽內加入1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕撥出預制膠梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
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CN-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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120V
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10-15mA/板膠
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4-10mA/板(ban)膠(jiao)
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50+min
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注：冰(bing)浴電泳
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2.4.2 BN-PAGE電泳：
BN-PAGE電泳外槽使用1×BN/CN電泳緩沖液；內槽開始電泳使用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電泳，等待電泳指示前沿到達凝膠1/3處時，將電泳緩沖液更換為1×BN/CN電泳緩沖液，繼續后續電泳，因為過多染料會影響蛋白在凝膠中的遷移以及蛋白后續的轉膜實驗。
BN-PAGE電泳(yong)條(tiao)件（一板(ban)膠）
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恒電壓(ya)
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起始電流
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電泳時間(jian)
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緩沖(chong)液
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120 V
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8-15 mA
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20-25 min
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1×藍色陰極緩(huan)沖(chong)液(ye)
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冰(bing)浴電泳
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指示前沿(yan)至凝膠頂部三分之二處，更(geng)換內槽(cao)緩沖(chong)液(ye)為1×BN/CN 電泳(yong)緩沖液
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恒電(dian)壓(ya)
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繼(ji)續電(dian)泳時間
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結束電流
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緩沖液
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120 V
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45 min +
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3-5 mA
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1×BN/CN電泳緩沖液
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冰浴電泳
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3. 轉膜：
BN-PAGE轉(zhuan)膜(mo)(mo)(mo)必須用(yong)PVDF膜(mo)(mo)(mo)，不(bu)能用(yong)NC膜(mo)(mo)(mo)，因(yin)為NC膜(mo)(mo)(mo)與(yu)G-250結合非常緊密(mi)，不(bu)易去除(chu)。轉(zhuan)膜(mo)(mo)(mo)后PVDF膜(mo)(mo)(mo)上的(de)藍色染料可以用(yong)無水甲醇漂洗去除(chu)。轉(zhuan)膜(mo)(mo)(mo)緩沖(chong)液推薦使用(yong)10×BN轉(zhuan)膜(mo)(mo)(mo)緩沖(chong)液（貨號：BC600P）。
4. 染色：
4.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液或常規考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。
4.2 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶清晰可見。
4.3 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。
4.4 觀察保存結果。
5. 實驗示例：
BN-PAGE 3-12% Precast Gel
穩(wen)壓(ya)120V 1.5 h 1×BN/CN電泳緩沖液 冰浴電泳
BN-PAGE 4-16% Precast Gel
恒壓 120V 2 h 1×BN/CN電泳緩(huan)沖液(ye) 冰(bing)浴電泳
K562 膜蛋白BN-WB檢測
樣品：膜蛋白提取樣品用2%DIG和1%DM增溶（ 貨號：RTD8111，動物膜蛋白提取試劑盒(細胞)） ，
胞漿蛋白CY做對照
電泳：3-12% BN預制膠（貨號：RTD6138-0312），穩壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上沿2/3處，
更換為無色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，電泳時間共83分鐘
膠預處理：膠浸泡于buffer中（12.5mM Tris，2%SDS，20%甘油，50mM DTT pH6.8），微波煮沸20秒，37度15min后轉膜
轉膜：0.45μm PVDF膜，10×BN轉膜緩沖液（貨號：BC600P）稀釋為1×BN轉膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA 2小時，未冰浴。
轉膜效果檢測：膜用麗春紅染色液染色（貨號：RTD6301）有可見條帶，膠用FastBlue蛋白染色液染色
（貨號：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉膜成功。膜用無水甲醇清洗5分鐘去除膜上藍色殘余。
封閉：Western快速封閉液（貨號：WR5020） RT 封閉10 分鐘；
圖1 一抗：兔單抗GAPDH 1:10000 RT 60min；羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光6秒
圖2 膜使用Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）（貨號：WS1200）37度15min，快封10分鐘，
一抗：兔Na-K ATPase 1:5000 RT 60min，羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光1秒
Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(RTD6139/RTD6138)
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1. [2021 IF=10.15] SlRIP1b
is a global organellar RNA editing factor, required for normal fruit
development in tomato plants
Author: Jinyan Li, Keru
Wang, Yongfang Yang, Yao Lu, Kaicheng Cui, Yajing Ji, Liqun Ma, Ke Cheng, Oren
Ostersetzer-Biran, Feng Li, Guiqin Qu, Benzhong Zhu, Daqi Fu, Yunbo Luo,
Hongliang Zhu
Journal: New
Phytologist 2023，Volume237, Issue4，February 2023，Pages 1188-1203
Institution： China Agricultural University
Paper link：
2.
[2022 IF=8.0] Tektin bundle interacting protein, TEKTIP1,
functions to stabilize the tektin bundle and axoneme in mouse sperm flagella
Author: Xinyan Geng,Huijuan Jin,
Lan Xia.Binbin Wang,Suren Chen
Journal: Cellular and Molecular Life Sciences (2024)
81:118
Institution: Beijing
Normal University
Paper link：
3.
[2022 IF2.6] What are the main proteins in the hemolymph
of Haemaphysalis flava ticks?
Author: Dan Li , Lei Liu , Zi-ling Liu
, Yuan Tian , Xin Gao，Tian-yin Cheng
Journal: Frontiers in Veterinary Science Published 17
July 2024
Institution: Hunan
Agricultural University
Paper link：