高純(chun)質粒小提試劑(ji)盒(he)（目(mu)錄號(hao)：RTP2101）
● 試(shi)劑盒(he)內容(rong)及保存：
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試(shi)劑盒組成
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RTP2101-02 （100次）
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RTP2101-03 （200次）
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貯存(cun)
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RNase A
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300 μl
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600 μl
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-20℃
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Lysis Dye
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600μl
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2×600μl
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室溫
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溶液P1
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30 ml
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60 ml
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室溫 （加(jia)入RNase
A后2-8℃保存）
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溶液P2
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30 ml
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60 ml
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室(shi)溫(wen)
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溶(rong)液P3
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40 ml
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80 ml
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室溫
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去蛋白液PD
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60 ml
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120 ml
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室溫
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漂洗(xi)液PW
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25 ml
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2×25
ml
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室溫(wen)
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洗脫緩沖液EB
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15 ml
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15 ml
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室(shi)溫
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質粒吸附(fu)柱CP
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100個
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2×100個(ge)
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室溫
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收集(ji)管（2 ml）
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100個
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2×100個
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室溫
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說明書
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1份
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1份
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● 儲存條(tiao)件和(he)效期：
本試(shi)劑盒在室溫(wen)（25℃左(zuo)右）干(gan)燥(zao)條件下，可保存(cun)1年；更(geng)長(chang)時間(jian)的保存(cun)可(ke)置于2–8℃。2–8℃保存條(tiao)件下，若溶液(ye)產生沉淀，應在使用(yong)前置于37℃下(xia)溶解沉淀至溶液(ye)澄清后再(zai)使用(yong)。單獨包裝的RNase A 在-20℃可穩(wen)定保存1年以上。加入(ru)RNase A后(hou)的溶(rong)液P1應置于2–8℃保存，可穩定(ding)保存半年。
● 產品(pin)簡介及使(shi)用(yong)說明：
本試劑盒采用經典的(de)堿裂解法裂解細(xi)菌，再通過離心(xin)吸附柱在高(gao)鹽狀態下特異性地結合DNA的特性，可以從1–5ml大腸桿菌LB培養液中快速(su)提取3–20μg純凈的高拷貝質粒DNA。提取的質粒可適用于(yu)各種常規操作，包括酶(mei)切、PCR、測序、連接和轉化等實(shi)驗(yan)。然而，對質粒(li)純度要(yao)求(qiu)更高(gao)的轉染(ran)實(shi)驗(yan)（要(yao)求(qiu)無內毒素），此試劑盒不(bu)能達到要(yao)求(qiu)。另外，盡管(guan)該試劑盒可以抽提較大的質粒(li)（>10kb），但我(wo)們不推薦使(shi)用。如果一定(ding)要使(shi)用，請參考以(yi)下方法：加大(da)菌體使(shi)用量（使(shi)用5–10 ml過夜培養物），同時按照比(bi)例增加P1、P2、P3的用量；洗(xi)脫(tuo)緩沖(chong)液應在70℃預熱(re)，在吸附和(he)洗(xi)脫時(shi)可以適當的延(yan)長時(shi)間，以增加提取效率，其它步驟相同。
● 產(chan)品特點：
1使用了Lysis Dye，菌(jun)體(ti)裂解是(shi)否完全一(yi)目了然。由于判斷菌(jun)體(ti)裂解和中和是(shi)否徹(che)底更主(zhu)要取決于操作(zuo)者的經驗，所以我們增(zeng)加了Lysis Dye（一種能使裂解/中和體(ti)系(xi)變換(huan)顏色的(de)試劑）來幫助觀察(cha)裂解/中和的程度(du)。加(jia)入P1后，Lysis Dye使(shi)菌(jun)液變(bian)為(wei)渾濁(zhuo)的紅色；加入P2后，Lysis Dye立即(ji)使溶液(ye)(ye)變為澄清(qing)(qing)的(de)紅(hong)(hong)(hong)色，裂解是(shi)否(fou)完(wan)全只要觀察紅(hong)(hong)(hong)色溶液(ye)(ye)是(shi)否(fou)澄清(qing)(qing)，如果紅(hong)(hong)(hong)色非常均一(yi)，表明裂解充分；在完(wan)全裂解的(de)體(ti)系中加入P3混(hun)勻后，體系(xi)立(li)即變為黃色，任何紅(hong)色的殘(can)留表明沒有完全混(hun)勻或者中(zhong)和不徹(che)底。
2 增加了去蛋(dan)白液PD，能更加徹底地去除蛋(dan)白污(wu)染，得到純度更高的質(zhi)粒。
● 準(zhun)備(bei)工作：
1 將試劑盒附帶的RNase A全部加入到溶液P1中(zhong)（如15ml P1中加(jia)入150μl RNase A），混勻后4℃貯存。
2 按照標(biao)簽所示在漂洗液(ye)PW中加入無水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存備(bei)用。
3 每次使用(yong)前請檢查溶(rong)液P2，溶(rong)液P3和(he)去蛋白液PD是否有沉淀生(sheng)成(cheng)，如果出現沉淀，37℃溫浴至(zhi)沉淀(dian)溶解(jie)后再使用。
● 使(shi)用(yong)Lysis Dye的標準操作步(bu)驟：
如非指出，所有離(li)心步驟均為使(shi)用臺式離(li)心機(ji)在室溫下離(li)心。
1． 取1–5 ml過夜(ye)培(pei)養的菌液加入離心(xin)管中，10,000g 離心1分鐘，盡量(liang)吸除上清。
注：菌液較多時可以通(tong)過幾次離(li)心將菌體(ti)沉淀收集到一(yi)個離(li)心管中。
2． 向(xiang)菌體沉(chen)淀的離心管中(zhong)加(jia)入250 μl溶液P1（請先檢(jian)查是否(fou)已加入RNaseA）和5μl Lysis Dye，使用移(yi)液(ye)器或渦(wo)旋振蕩(dang)器徹底懸浮細菌細胞沉淀，此時溶液(ye)為渾濁的紅色。
注：如果有未徹底(di)混勻(yun)的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏(pian)低。
3． 加入250 μl溶液P2，溫和地上(shang)下翻轉6–8次使菌體充分裂解(jie)，此時(shi)溶液變為澄清的紅色。
注：溫和(he)地混合，不(bu)要劇烈震蕩，以(yi)免污染基(ji)因組DNA；所用時間絕對(dui)不應超過5分鐘 ，以免質粒受到破壞；紅色溶液應(ying)該透明(ming)均一，如有渾濁紅色顆粒，表明(ming)裂解不充(chong)分，會大大降低質粒提取效率。
4． 加(jia)入350 μl溶液P3，立即溫和地上(shang)下翻轉，充(chong)分混勻(yun)(yun)，混勻(yun)(yun)充(chong)分的(de)標志是溶液完全(quan)呈透(tou)明的(de)黃色，如有(you)可(ke)見(jian)紅(hong)色，說明混勻(yun)(yun)不(bu)徹(che)底(di)。10,000g 離心10分鐘。
注：P3加(jia)入后應立即混(hun)合，避免產(chan)生局部沉淀(dian)。
左側(ce)未完全混(hun)勻，有(you)紅色；右側(ce)完全混(hun)勻，呈均(jun)勻黃(huang)色
5． 小心地將上清轉移到(dao)吸(xi)附柱CP中（吸(xi)附柱放入收(shou)集管中），10,000g離(li)心30–60秒，倒掉收(shou)集管中的廢(fei)液，將(jiang)吸附柱CP重新(xin)放回收集管中。
6．向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD，10,000g離心30秒(miao)，倒掉收集管(guan)中的廢(fei)液，將吸(xi)附柱CP重新放回收集(ji)管中。
7． 向(xiang)吸附柱CP中加(jia)入(ru)700 μl漂(piao)洗液(ye)PW（請先檢查是否(fou)已加入無(wu)水乙醇），10,000g 離心30–60秒，倒掉收集管中的(de)廢液，將吸附柱CP重(zhong)新放(fang)回收集管中。
8. 向吸附柱CP中加入500 μl漂(piao)洗液PW，10,000g 離(li)心30–60秒，倒掉(diao)收集(ji)管中的廢液。
9. 將吸附柱CP置于重(zhong)新放回收集管中，10,000g 離(li)心2分鐘。
注：此(ci)步(bu)驟目(mu)的(de)是將(jiang)吸附(fu)柱中(zhong)殘余的(de)漂(piao)洗液去除，絕對不可省(sheng)略，因為(wei)漂(piao)洗液中(zhong)乙醇的(de)殘留會影響(xiang)后續實驗（酶切，PCR等(deng)）。
10. 將吸附柱CP置(zhi)于(yu)一個干凈(jing)的1.5ml離(li)心管(guan)中，向吸附膜(mo)的(de)中(zhong)央部位懸(xuan)空滴加50–100 μl洗脫(tuo)緩(huan)沖液EB，室溫放置(zhi)2分鐘(zhong)，10,000g 離心2分(fen)鐘將質(zhi)粒溶(rong)液收集到(dao)離心管中，-20℃保存。
注：● 為了(le)增加質粒的(de)回收效率，可將得到的(de)洗脫液重新加入離(li)(li)心吸附柱中，再次(ci)離(li)(li)心收集。
● 洗脫緩沖液體積(ji)不應少于(yu)50
μl，體積過小(xiao)影(ying)響回收效率。
● 洗脫液(ye)的pH值對于洗(xi)脫效率有(you)很大影響。若用水做洗(xi)脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值(zhi)低(di)于7.0會降低
洗脫效(xiao)率。
●不使用(yong)Lysis Dye的標準操(cao)作步驟：
如非指出，所有離(li)心(xin)步驟均為使用臺式離(li)心(xin)機在室溫(wen)下離(li)心(xin)。
1． 取1–5 ml過夜(ye)培養(yang)的菌液加入離心管中，10,000
g離心(xin)1分(fen)鐘，盡量(liang)吸(xi)除上清(qing)。
注(zhu)：菌液較多時(shi)可(ke)以通過幾次離(li)心將(jiang)菌體沉淀收集到一個離(li)心管中(zhong)。
2． 向菌體(ti)沉淀的離心管(guan)中(zhong)加入250 μl溶液P1（請先檢查(cha)是否已加入RNaseA），使用移液(ye)器或(huo)渦旋振蕩(dang)器徹底懸浮(fu)細菌細胞沉淀(dian)。
注(zhu)：如果有未徹底混勻的菌(jun)塊(kuai)，會(hui)影響(xiang)裂(lie)解，導致提取(qu)量和(he)純(chun)度偏低。
3． 加(jia)入(ru)250 μl溶(rong)液P2，溫和地上(shang)下(xia)翻轉6–8次使菌體(ti)充分裂解。
注：溫和(he)地混合，不(bu)要劇烈震蕩，以免污(wu)染基因(yin)組DNA；所(suo)用時(shi)間(jian)絕對不(bu)應超過5分(fen)鐘，以免(mian)質粒受到破壞。
4． 加入350 μl溶液P3，立即溫和地(di)上下翻轉6–8次(ci)，充分混(hun)勻，此時會出現白(bai)色絮狀沉淀。10,000g 離心(xin)10分(fen)鐘。
注：P3加入后應立即混合(he)，避免產生局(ju)部沉淀(dian)(dian)。如果上清中還有微小白(bai)色沉淀(dian)(dian)，可再(zai)次離心后取(qu)上清。
5． 小心地將上清轉移到(dao)吸附(fu)柱CP中(zhong)（吸附柱放入收集管中），10,000g 離心30–60秒，倒掉收集(ji)管中的廢液，將吸(xi)附(fu)柱CP重新(xin)放回收集管中。
6．向吸(xi)附柱CP中加入(ru)500 μl去蛋(dan)白液(ye)PD，10,000g離(li)心30秒，倒掉(diao)收(shou)集管中的廢液，將吸附柱CP重新放(fang)回收(shou)集管中。
7． 向吸(xi)附柱CP中加入700 μl漂洗(xi)液PW（請先(xian)檢查是否(fou)已(yi)加入無水乙醇），10,000g 離心30–60秒(miao)，倒掉(diao)收集管(guan)中的廢(fei)液，將吸附柱CP重新放回收集管中。
7 向吸附柱CP中(zhong)加入500
μl漂洗(xi)液PW，10,000g 離(li)心30–60秒，倒掉(diao)收集管中(zhong)的廢液(ye)。
8. 將吸(xi)附柱CP置于收集管(guan)中，10,000g 離心2分鐘(zhong)。
注：此(ci)步(bu)驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗(xi)液去(qu)除，絕對(dui)不(bu)可省(sheng)略，因為漂洗(xi)液中乙醇(chun)的殘留會影響后續實驗（酶切，PCR等）。
9． 將(jiang)吸附柱CP置于一(yi)個(ge)干凈的(de)1.5ml離(li)心管中，向吸(xi)附膜的中(zhong)央(yang)部位(wei)懸空滴(di)加50–100
μl洗脫(tuo)緩沖液EB，室溫放置2分鐘，10,000g離心2分鐘將質粒溶液收集到離心管(guan)中，-20℃保存。
注：● 為了增加質(zhi)粒的(de)(de)回收(shou)效(xiao)率，可將得到的(de)(de)洗脫(tuo)液重新加入離(li)心吸(xi)附(fu)柱中，再次(ci)離(li)心收(shou)集。
● 洗脫(tuo)緩沖(chong)液(ye)體積不應少于50 μl，體積(ji)過(guo)小影響(xiang)回收效率。
● 洗脫液的pH值對于洗(xi)脫效(xiao)率有很大影(ying)響。若(ruo)用水做洗(xi)脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值(zhi)低于7.0會降(jiang)低(di)洗(xi)脫效率。
質粒提取試劑盒 RTP2101/RTP2102發表文章
1. A weird DNA band in PCR and its cause.
Author: Chang Shenghe, Sun Wei, Zhou Zhaoxi, Li Jingyang, Dai Minjie, Shu Haiyan
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Journal of Plant Science & Molecular
Breeding Volume 5 Article 2 2016
Institution：Haikou
experimental station, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Paper link：
2. [2017 IF=4.076] Application of Real-Time Quantitative PCR
to Detect Mink Circovirus in Naturally and Experimentally Infected Minks.
Author: Xingyang Cui, Yunjia Shi, Lili Zhao, Shanshan Gu, Chengwei Wei, Yan
Yang,Shanshan Wen, Hongyan Chen and Junwei Ge
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Fronties in Microbiology May 2018 | Volume 9 | Article 937
Institution：College of
Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University
Paper link：
3. [2018 IF=8.063] ATF4 destabilizes RET through nonclassical
GRP78 inhibition to enhance chemosensitivity to bortezomib in human
osteosarcoma
Author: Jie Luo, Yuanzheng Xia, Yong Yin, Jun Luo, Mingming Liu, Hao Zhang, Chao
Zhang, Yucheng Zhao, Lei Yang, and Lingyi Kong
Product: RTP2101 高純質粒小提試劑盒
Journal: Theranostics 2019, Vol. 9, Issue 21
Institution：School of
Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University
Paper link：
4. [2020 IF=1.336] Isopentenyl Diphosphate Isomerase (IPI)
Gene Silencing Negatively Afects Patchouli Alcohol Biosynthesis
in Pogostemon cablin
Author: Wuping Yan,Yuzhang Yang,Yougen Wu,Jing Yu,Junfeng Zhang,
Dongmei Yang, Zeeshan Ul Haq Muhammad
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Plant Molecular Biology Reporter Published 27 January 2021
Institution：College
of Horticulture, Hainan University
Paper link：
5. [2022 IF=2] Genomic characterization and phylogenetic
analysis of Aleutian mink disease virus identified in a sudden death mink case
Author: Xingyang Cui, Yan Yang, Fang Wang, Jilong Luo, Ping Zhang, Hongyan Chen,
Lili Zhao, Junwei Ge
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Comparative Immunology, Microbiology
and Infectious Diseases. Vo101, October 2023, 102052
Institution：College of
Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University
Paper link：