高純(chun)質(zhi)粒小提試劑盒(he)（目錄號：RTP2101）
● 試劑盒內容及(ji)保存：
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試劑盒組成
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RTP2101-02 （100次）
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RTP2101-03 （200次）
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貯存
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RNase A
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300 μl
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600 μl
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-20℃
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Lysis Dye
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600μl
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2×600μl
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室溫
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溶(rong)液P1
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30 ml
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60 ml
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室溫(wen) （加入(ru)RNase
A后2-8℃保存）
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溶(rong)液P2
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30 ml
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60 ml
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室(shi)溫
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溶液P3
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40 ml
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80 ml
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室(shi)溫
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去蛋白液PD
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60 ml
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120 ml
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室溫
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漂(piao)洗液PW
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25 ml
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2×25
ml
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室溫
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洗脫緩沖液EB
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15 ml
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15 ml
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室(shi)溫(wen)
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質(zhi)粒吸附柱CP
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100個
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2×100個
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室溫
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收集(ji)管（2 ml）
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100個(ge)
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2×100個
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室溫
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說明書
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1份
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1份
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● 儲存條件和(he)效期(qi)：
本試劑盒在室溫(wen)（25℃左右(you)）干燥條件下，可(ke)保存1年；更(geng)長時間的(de)保存可(ke)置于2–8℃。2–8℃保存(cun)條件下(xia)，若溶液產(chan)生沉(chen)淀(dian)，應(ying)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨包裝的RNase A 在(zai)-20℃可穩定保存1年以上。加入RNase A后(hou)的溶液P1應置于2–8℃保存(cun)，可穩定(ding)保存(cun)半年。
● 產(chan)品簡介及(ji)使用說明：
本(ben)試劑盒采用(yong)經典的堿裂(lie)解(jie)法裂(lie)解(jie)細菌，再通過離心吸附(fu)柱(zhu)在高鹽(yan)狀態下特異性地結合DNA的特性，可以從(cong)1–5ml大腸桿菌(jun)LB培養液中快速提取3–20μg純凈的高拷貝(bei)質粒(li)DNA。提取的質粒可適用(yong)于各種常(chang)規操(cao)作，包括酶切、PCR、測(ce)序、連接和轉(zhuan)化等實(shi)驗。然(ran)而，對質粒(li)純度(du)要求更高(gao)的轉(zhuan)染(ran)實(shi)驗（要求無內(nei)毒素），此試(shi)劑盒(he)不能達到要求。另外，盡管該試(shi)劑盒(he)可(ke)以(yi)抽(chou)提較大的質粒(li)（>10kb），但我們不推薦使(shi)(shi)用。如(ru)果一定要(yao)使(shi)(shi)用，請參考以(yi)下方(fang)法：加大菌體使(shi)(shi)用量（使(shi)(shi)用5–10 ml過夜培養物(wu)），同時按照比(bi)例(li)增加P1、P2、P3的用(yong)量；洗脫(tuo)緩沖(chong)液應在70℃預熱，在吸附(fu)和(he)洗脫時可以適當的(de)延長時間(jian)，以增加提取效率，其它(ta)步(bu)驟相同。
● 產(chan)品特點：
1使用了Lysis Dye，菌(jun)體(ti)裂(lie)解是否完全一目了然。由于(yu)判(pan)斷菌(jun)體(ti)裂(lie)解和(he)中和(he)是否徹底更主(zhu)要(yao)取(qu)決于(yu)操作者的經驗，所以我(wo)們增加(jia)了Lysis Dye（一種能使裂解/中和體(ti)系變換顏色的(de)試(shi)劑）來幫(bang)助觀察裂解/中(zhong)和(he)的程(cheng)度(du)。加入(ru)P1后，Lysis Dye使菌液變為(wei)渾濁的紅(hong)色；加入P2后，Lysis Dye立即使溶液變為澄(cheng)清的(de)(de)紅(hong)(hong)色，裂(lie)解(jie)是否完(wan)全只要觀察紅(hong)(hong)色溶液是否澄(cheng)清，如果紅(hong)(hong)色非常均(jun)一，表明裂(lie)解(jie)充分；在完(wan)全裂(lie)解(jie)的(de)(de)體(ti)(ti)系(xi)中加入(ru)P3混(hun)勻后(hou)，體(ti)(ti)系立即變為(wei)黃(huang)色，任何紅色的殘(can)留表明沒有完全(quan)混(hun)勻或者中和不徹底。
2 增加(jia)了去蛋白(bai)液(ye)PD，能更(geng)加徹底地去除蛋白污染，得(de)到純度更(geng)高的質粒。
● 準(zhun)備工作(zuo)：
1 將試劑(ji)盒附帶的RNase A全部加入到溶液P1中（如15ml P1中(zhong)加入150μl RNase A），混勻(yun)后4℃貯存。
2 按(an)照標簽所示在漂洗液(ye)PW中加入(ru)無水乙(yi)醇，混勻(yun)后蓋緊瓶蓋后室溫(wen)貯存備用(yong)。
3 每(mei)次(ci)使(shi)用前請檢查溶液P2，溶液(ye)P3和去(qu)蛋白液PD是否有沉(chen)淀(dian)生成，如果出現沉(chen)淀(dian)，37℃溫浴(yu)至(zhi)沉(chen)淀溶解后再使用。
● 使用Lysis Dye的標準操作步驟：
如非指出(chu)，所有離心(xin)步驟(zou)均為(wei)使用臺(tai)式(shi)離心(xin)機在室溫下離心(xin)。
1． 取(qu)1–5 ml過夜培養的菌液加入離心管中，10,000g 離心(xin)1分鐘，盡量吸除(chu)上清。
注：菌(jun)液較(jiao)多(duo)時可(ke)以通過幾次離(li)(li)心(xin)(xin)將菌(jun)體沉淀收集到一個離(li)(li)心(xin)(xin)管中。
2． 向菌體沉(chen)淀的離心(xin)管(guan)中加入250 μl溶(rong)液P1（請先檢(jian)查是否(fou)已加入RNaseA）和5μl Lysis Dye，使用移液器或渦旋振蕩(dang)器徹底(di)懸浮細菌(jun)細胞(bao)沉淀，此(ci)時溶液為(wei)渾濁的紅色。
注：如(ru)果有未徹底混(hun)勻(yun)的菌塊，會影響(xiang)裂解，導致(zhi)提取量和純度偏(pian)低(di)。
3． 加入250 μl溶液P2，溫和地上下(xia)翻轉6–8次(ci)使菌體充分裂解，此(ci)時溶液變為澄清的紅色。
注：溫和地混合(he)，不要劇烈震蕩(dang)，以(yi)免污染基因組(zu)DNA；所(suo)用時(shi)間絕對不(bu)應(ying)超過5分鐘 ，以免質粒受(shou)到破(po)壞；紅色(se)溶液應該(gai)透明均一，如有渾(hun)濁(zhuo)紅色(se)顆粒，表明裂解不充(chong)分，會大大降(jiang)低質粒提(ti)取效率。
4． 加入350 μl溶液P3，立即(ji)溫和地上下翻轉，充分混勻，混勻充分的(de)標志是溶(rong)液完全呈透(tou)明(ming)的(de)黃(huang)色(se)(se)，如有(you)可見紅色(se)(se)，說明(ming)混勻不(bu)徹底。10,000g 離心(xin)10分鐘。
注：P3加入后應立即(ji)混合，避免(mian)產生局部沉淀。
左(zuo)側未(wei)完全(quan)混(hun)勻(yun)，有紅色；右(you)側完全(quan)混(hun)勻(yun)，呈均勻(yun)黃色
5． 小心(xin)地將(jiang)上清轉移到吸(xi)附柱CP中（吸附柱放入收集管中），10,000g離心(xin)30–60秒(miao)，倒掉收(shou)集管(guan)中的廢液，將吸附柱CP重新(xin)放回收集(ji)管中。
6．向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白(bai)液PD，10,000g離心(xin)30秒，倒掉(diao)收集管(guan)中的廢液(ye)，將(jiang)吸附柱(zhu)CP重(zhong)新放回收集管中。
7． 向吸附柱CP中加(jia)入700 μl漂洗液(ye)PW（請先檢(jian)查是否(fou)已(yi)加入無水乙醇），10,000g 離心30–60秒(miao)，倒掉(diao)收(shou)集管中的廢液，將吸(xi)附柱CP重新放回收(shou)集管(guan)中。
8. 向吸附柱CP中加入500 μl漂洗(xi)液PW，10,000g 離心30–60秒(miao)，倒(dao)掉收集管中的廢液。
9. 將吸附(fu)柱(zhu)CP置(zhi)于重新(xin)放回收集管中，10,000g 離心2分鐘(zhong)。
注：此步驟目的(de)(de)是將吸附柱中(zhong)殘余的(de)(de)漂(piao)(piao)洗(xi)(xi)液去除(chu)，絕對不可(ke)省略，因為漂(piao)(piao)洗(xi)(xi)液中(zhong)乙醇(chun)的(de)(de)殘留會(hui)影響后續實驗（酶(mei)切，PCR等(deng)）。
10. 將(jiang)吸附柱CP置于(yu)一(yi)個干凈的(de)1.5ml離心管中，向(xiang)吸附(fu)膜的中(zhong)央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩(huan)沖液EB，室溫(wen)放(fang)置2分鐘，10,000g 離心(xin)2分(fen)鐘將(jiang)質粒(li)溶液收集到離心管中，-20℃保存(cun)。
注：● 為(wei)了增加質(zhi)粒的回收(shou)效率，可將得到的洗脫液重(zhong)新加入離心吸附(fu)柱中，再(zai)次離心收(shou)集(ji)。
● 洗脫緩沖液體(ti)積不應少于50
μl，體積(ji)過小影(ying)響(xiang)回(hui)收效率。
● 洗脫液的pH值對于(yu)洗脫(tuo)效率有很(hen)大(da)影響。若用水做洗脫(tuo)液應保證其pH值在7.0-8.5范(fan)圍內，pH值低于7.0會降低(di)
洗脫效率(lv)。
●不使用Lysis Dye的標(biao)準操(cao)作步驟：
如非指出，所(suo)有離(li)心步驟均(jun)為使用臺式離(li)心機(ji)在室溫(wen)下(xia)離(li)心。
1． 取(qu)1–5 ml過夜培養的(de)菌液加入離心管中，10,000
g離心1分鐘，盡量吸(xi)除上清。
注：菌液較(jiao)多時可以通過幾次離(li)心將菌體沉(chen)淀收集到一個離(li)心管中。
2． 向菌體(ti)沉(chen)淀的離(li)心管中(zhong)加入250 μl溶液P1（請先檢查是否已(yi)加入RNaseA），使用移(yi)液器(qi)或渦(wo)旋(xuan)振蕩器(qi)徹底懸(xuan)浮細菌細胞沉淀(dian)。
注：如果有未(wei)徹底(di)混勻的菌塊(kuai)，會影響裂解，導(dao)致提(ti)取(qu)量和純度偏低(di)。
3． 加入250 μl溶液P2，溫(wen)和地上下(xia)翻轉6–8次使菌體充(chong)分裂解。
注：溫和地混合，不(bu)要劇烈震(zhen)蕩，以免(mian)污染基(ji)因組DNA；所用(yong)時間絕對不應超過(guo)5分(fen)鐘，以免(mian)質(zhi)粒受到破壞。
4． 加入(ru)350 μl溶液(ye)P3，立即溫和地(di)上下翻轉(zhuan)6–8次，充分混勻，此時會出現白色(se)絮狀沉淀。10,000g 離心10分鐘。
注：P3加入后(hou)應立即混(hun)合，避免產生局(ju)部(bu)沉(chen)淀(dian)。如果(guo)上清中還有微小白色沉(chen)淀(dian)，可再次離心后(hou)取上清。
5． 小心(xin)地將上清轉(zhuan)移到(dao)吸附柱(zhu)CP中（吸附(fu)柱放(fang)入(ru)收(shou)集管中），10,000g 離心30–60秒，倒掉收集(ji)管中的廢(fei)液，將吸附柱CP重新放回(hui)收集管中。
6．向(xiang)吸附柱(zhu)CP中加入(ru)500 μl去蛋白液PD，10,000g離(li)心30秒，倒掉收集管(guan)中的廢(fei)液，將吸(xi)附柱(zhu)CP重新放回收集管中。
7． 向吸(xi)附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（請先檢查是否已(yi)加入(ru)無(wu)水乙醇(chun)），10,000g 離心30–60秒，倒(dao)掉(diao)收集(ji)管中的廢液，將吸(xi)附柱CP重新放回收集管中。
7 向吸附(fu)柱CP中加入500
μl漂洗液PW，10,000g 離(li)心30–60秒，倒掉收集管中的(de)廢(fei)液。
8. 將吸附柱CP置于收集管中，10,000g 離心2分鐘。
注：此步驟(zou)目的(de)(de)是將(jiang)吸附(fu)柱中殘(can)余的(de)(de)漂洗液去除，絕對不可省略，因為漂洗液中乙醇的(de)(de)殘(can)留(liu)會影響(xiang)后(hou)續實驗（酶(mei)切，PCR等）。
9． 將吸附柱CP置于一個干凈(jing)的1.5ml離心管中(zhong)，向吸(xi)附(fu)膜(mo)的中央部位懸空(kong)滴加50–100
μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘(zhong)，10,000g離心2分鐘(zhong)將質粒(li)溶液收(shou)集到離心管中，-20℃保(bao)存。
注：● 為了增加質粒(li)的(de)回收效率(lv)，可將得到的(de)洗(xi)脫液重新加入離心吸附(fu)柱中，再次離心收集。
● 洗(xi)脫緩沖液體積不應(ying)少于50 μl，體積過(guo)小影響回收效率。
● 洗脫(tuo)液的pH值(zhi)對于洗(xi)脫效率(lv)有很大影響(xiang)。若用(yong)水做洗(xi)脫液應保證其pH值在7.0-8.5范(fan)圍(wei)內，pH值低于7.0會降低洗脫(tuo)效率。
質粒提取試劑盒 RTP2101/RTP2102發表文章
1. A weird DNA band in PCR and its cause.
Author: Chang Shenghe, Sun Wei, Zhou Zhaoxi, Li Jingyang, Dai Minjie, Shu Haiyan
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Journal of Plant Science & Molecular
Breeding Volume 5 Article 2 2016
Institution：Haikou
experimental station, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Paper link：
2. [2017 IF=4.076] Application of Real-Time Quantitative PCR
to Detect Mink Circovirus in Naturally and Experimentally Infected Minks.
Author: Xingyang Cui, Yunjia Shi, Lili Zhao, Shanshan Gu, Chengwei Wei, Yan
Yang,Shanshan Wen, Hongyan Chen and Junwei Ge
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Fronties in Microbiology May 2018 | Volume 9 | Article 937
Institution：College of
Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University
Paper link：
3. [2018 IF=8.063] ATF4 destabilizes RET through nonclassical
GRP78 inhibition to enhance chemosensitivity to bortezomib in human
osteosarcoma
Author: Jie Luo, Yuanzheng Xia, Yong Yin, Jun Luo, Mingming Liu, Hao Zhang, Chao
Zhang, Yucheng Zhao, Lei Yang, and Lingyi Kong
Product: RTP2101 高純質粒小提試劑盒
Journal: Theranostics 2019, Vol. 9, Issue 21
Institution：School of
Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University
Paper link：
4. [2020 IF=1.336] Isopentenyl Diphosphate Isomerase (IPI)
Gene Silencing Negatively Afects Patchouli Alcohol Biosynthesis
in Pogostemon cablin
Author: Wuping Yan,Yuzhang Yang,Yougen ;Wu,Jing Yu,Junfeng Zhang,
Dongmei Yang, Zeeshan Ul Haq Muhammad
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Plant Molecular Biology Reporter Published 27 January 2021
Institution：College
of Horticulture, Hainan University
Paper link：
5. [2022 IF=2] Genomic characterization and phylogenetic
analysis of Aleutian mink disease virus identified in a sudden death mink case
Author: Xingyang Cui, Yan Yang, Fang Wang, Jilong Luo, Ping Zhang, Hongyan Chen,
Lili Zhao, Junwei Ge
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Comparative Immunology, Microbiology
and Infectious Diseases. Vo101, October 2023, 102052
Institution：College of
Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University
Paper link：