普通質粒小提試劑盒（目錄號：RTP2102）
● 試劑(ji)盒內容(rong)及保(bao)存：
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試劑盒組成
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RTP2102-02 （100次）
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RTP2102-03 （200次）
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貯存
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RNase
A
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300
μl
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600
μl
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-20℃
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Lysis
Dye
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600μl
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2×600μl
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室(shi)溫
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溶(rong)液P1
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30
ml
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60
ml
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室溫 （加(jia)入(ru)RNase A后2-8℃保存）
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溶液P2
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30
ml
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60
ml
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室溫
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溶液(ye)P3
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40
ml
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80
ml
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室溫
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漂(piao)洗液PW
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25
ml
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2×25
ml
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室溫
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洗(xi)脫緩沖(chong)液EB
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15
ml
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15
ml
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室溫(wen)
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質(zhi)粒吸附柱CP
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100個
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200個
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室(shi)溫
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收(shou)集管（2
ml）
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100個
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200個
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室溫
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說(shuo)明書
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1份
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1份(fen)
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● 儲(chu)存條件(jian)和(he)效期：
本試劑盒在室溫（25℃左右）干燥條件下，可保(bao)存1年；更長時間的保存可置于2–8℃。2–8℃保(bao)存條件下，若溶液產生沉淀，應在使(shi)用前置于37℃下溶(rong)解沉(chen)淀至溶(rong)液澄清后再(zai)使用。單獨包(bao)裝的RNase
A 在(zai)-20℃可穩定保存1年(nian)以上。加入(ru)RNase
A后的(de)溶液P1應置于2–8℃保(bao)存(cun)，可穩定保(bao)存(cun)半年。
● 產品簡介(jie)及(ji)使用說(shuo)明：
本試(shi)劑盒采用經典的堿(jian)裂解(jie)(jie)法裂解(jie)(jie)細菌，再通過(guo)離心吸附柱在(zai)高鹽(yan)狀態(tai)下特(te)異性地結合(he)DNA的特性，可(ke)以從1–5ml大腸(chang)桿菌LB培養液中快速提(ti)取3–20μg純凈的(de)高(gao)拷貝質粒(li)DNA。提(ti)取的質粒可(ke)適用(yong)于(yu)各種常規(gui)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等實(shi)驗。然而，對質(zhi)粒純度要求更高的(de)轉染(ran)實驗（要求無(wu)內(nei)毒(du)素(su)），此試劑盒不能達(da)到(dao)要求。另外，盡管該試劑盒可以抽提較大的(de)質(zhi)粒（>10kb），但(dan)我們不推薦使(shi)用(yong)(yong)。如果一定要使(shi)用(yong)(yong)，請參考以下方法：加大(da)菌體使(shi)用量（使(shi)用5–10 ml過(guo)夜培養(yang)物），同時按照比例增(zeng)加P1、P2、P3的用量；洗脫緩沖液(ye)應在70℃預(yu)熱，在吸附和洗脫時可以適當的延(yan)長時間，以增(zeng)加(jia)提(ti)取(qu)效率，其它步驟相(xiang)同(tong)。
● 產品(pin)特點：
使(shi)用了(le)Lysis Dye，菌體裂解是否完全一目了(le)然(ran)。由(you)于(yu)判斷菌體裂解和中和是否徹底更主要取決于(yu)操作(zuo)者(zhe)的經(jing)驗，所以我們增加了(le)Lysis Dye（一種能使裂解/中和體(ti)系(xi)變換顏色的試劑）來(lai)幫助觀察裂解/中和的程度。加入P1后，Lysis Dye使菌液(ye)變為(wei)渾濁的紅色(se)；加入P2后(hou)，Lysis Dye立即使溶液變為澄清的(de)紅色(se)，裂解(jie)是否完全只要觀(guan)察(cha)紅色(se)溶液是否澄清，如果紅色(se)非(fei)常(chang)均一，表(biao)明(ming)裂解(jie)充分；在(zai)完全裂解(jie)的(de)體(ti)系中(zhong)加(jia)入P3混(hun)勻(yun)后，體系立即變為黃色(se)，任(ren)何紅(hong)色(se)的(de)殘留表(biao)明沒(mei)有完全(quan)混(hun)勻(yun)或者中和不徹底(di)。
● 準備工(gong)作：
1 將試劑盒附(fu)帶的RNase
A全部加入到溶液(ye)P1中（如15ml P1中加入150μl
RNase A），混勻后4℃貯存(cun)。
2 按照標(biao)簽所(suo)示在漂洗液PW中加入無水乙醇，混勻后蓋(gai)緊瓶蓋(gai)后室(shi)溫(wen)貯存備用。
3 每次使(shi)用前請檢查溶液(ye)P2、溶液(ye)P3是(shi)否有沉淀(dian)(dian)生(sheng)成，如果(guo)出現沉淀(dian)(dian)，37℃溫浴至沉淀溶解后再(zai)使(shi)用(yong)。
● 使用Lysis Dye的(de)標準(zhun)操作步驟：
如非(fei)指出(chu)，所(suo)有(you)離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。
1． 取1–5 ml過夜培(pei)養的菌液加(jia)入離心管中，10,000g 離(li)心1分鐘(zhong)，盡量(liang)吸除(chu)上清。
注(zhu)：菌液(ye)較多時可以通(tong)過幾次離心(xin)將菌體(ti)沉淀收集到一個離心(xin)管(guan)中。
2． 向菌(jun)體(ti)沉淀的離心管中加(jia)入250 μl溶液P1（請(qing)先檢查(cha)是否已加入(ru)RNaseA）和5μl Lysis Dye，使用移液器或(huo)渦旋(xuan)振蕩器徹(che)底懸浮細菌細胞沉淀，此時溶液為渾濁的紅(hong)色。
注：如果有(you)未(wei)徹底混勻的菌塊，會影(ying)響裂解(jie)，導致(zhi)提取量和純度(du)偏(pian)低。
3． 加入250 μl溶液P2，溫和(he)地(di)上下(xia)翻轉(zhuan)6–8次使菌體充分裂(lie)解，此時溶液變(bian)為澄清(qing)的(de)紅色。
注(zhu)：溫(wen)和地混合，不(bu)要(yao)劇烈震蕩(dang)，以免污染基(ji)因組DNA；所用時(shi)間絕對不應超(chao)過5分鐘(zhong) ，以免質粒(li)受到破壞；紅(hong)色溶液應該透(tou)明均一(yi)，如有(you)渾濁紅(hong)色顆粒(li)，表(biao)明裂解(jie)不充(chong)分，會大(da)大(da)降低質粒(li)提取效率。
4． 加入350 μl溶液P3，立即溫和地上下(xia)翻轉，充分(fen)混(hun)勻，混(hun)勻充分(fen)的(de)標(biao)志是溶(rong)液完(wan)全呈透明的(de)黃色，如有(you)可見紅色，說明混(hun)勻不徹底。10,000g 離(li)心(xin)10分鐘。
注(zhu)：P3加入后應(ying)立(li)即混合，避免產生(sheng)局部(bu)沉淀。
左側未完全混勻，有紅色；右側完全混勻，呈均勻黃色
5． 小心地(di)將上清轉移到吸附(fu)柱(zhu)CP中(zhong)（吸附柱(zhu)放入(ru)收集(ji)管中），10,000g離心30–60秒，倒掉收集管(guan)中的廢液，將吸附柱CP重新放回收(shou)集管(guan)中。
6． 向吸附柱CP中加(jia)入700 μl漂洗(xi)液PW（請先(xian)檢(jian)查(cha)是(shi)否已加入無水乙(yi)醇(chun)），10,000g 離心(xin)30–60秒(miao)，倒掉收集管(guan)中的廢液，將(jiang)吸附柱(zhu)CP重新放回收集管(guan)中。
7 向吸附柱CP中加入500
μl漂洗(xi)液PW，10,000g 離心30–60秒，倒(dao)掉收集管中的廢液。
8. 將(jiang)吸附柱CP重(zhong)新(xin)放回收集管中，10,000g 離心2分鐘。
注：此步驟目的是將吸(xi)附柱中(zhong)殘(can)余的漂洗(xi)液去(qu)除，絕對不可省略，因為漂洗(xi)液中(zhong)乙醇的殘(can)留(liu)會影響后(hou)續實驗（酶切，PCR等）。
9. 將吸附柱CP置(zhi)于一個(ge)干凈的(de)1.5ml離心管中，向吸附(fu)膜的中(zhong)央部位懸空滴加50–100
μl洗脫緩(huan)沖(chong)液EB，室(shi)溫放(fang)置2分鐘，10,000g離(li)心2分鐘(zhong)將質粒溶(rong)液收集到離心管中，-20℃保存(cun)。
注：● 為(wei)了增加質粒的回收效率，可將得到的洗脫(tuo)液重(zhong)新加入離(li)心吸附柱中，再(zai)次離(li)心收集(ji)。
● 洗脫(tuo)緩沖液體(ti)積(ji)不應少于50
μl，體積(ji)過小影響回收(shou)效率。
● 洗脫液的pH值對于洗脫(tuo)效(xiao)率有很大影(ying)響。若用水做(zuo)洗脫(tuo)液應(ying)保證(zheng)其pH值在(zai)7.0-8.5范(fan)圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率(lv)。
●不使用Lysis Dye的標準(zhun)操作(zuo)步(bu)驟(zou)：
如非指出，所有離心步驟均為(wei)使用臺式離心機在室溫下(xia)離心。
1． 取1–5 ml過(guo)夜培養的菌液加(jia)入(ru)離心管中，10,000
g離心(xin)1分鐘，盡量吸(xi)除(chu)上清。
注(zhu)：菌液(ye)較(jiao)多(duo)時可以通過幾(ji)次離心將菌體沉淀(dian)收集到一個(ge)離心管中。
2． 向菌體沉淀的離心管中加入250 μl溶液P1（請先檢(jian)查是否(fou)已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩(dang)器徹底懸浮細菌細胞(bao)沉淀(dian)。
注：如(ru)果有(you)未徹底混勻的菌塊，會(hui)影響裂解(jie)，導(dao)致提取量和純度(du)偏低(di)。
3． 加入250 μl溶液P2，溫和地上下翻轉6–8次使菌體充分裂解。
注：溫(wen)和地混合，不(bu)要劇(ju)烈震蕩，以免(mian)污染(ran)基因組DNA；所用(yong)時間絕對不(bu)應超過(guo)5分鐘(zhong)，以免質粒受到破壞。
4． 加入350 μl溶液P3，立(li)即(ji)溫和(he)地上下翻(fan)轉(zhuan)6–8次(ci)，充(chong)分混勻，此時會出(chu)現白色(se)絮(xu)狀沉淀(dian)。10,000g 離心(xin)10分鐘。
注(zhu)：P3加入后應立即混合，避免產生局(ju)部沉(chen)淀(dian)。如(ru)果(guo)上(shang)(shang)清中還有微小(xiao)白(bai)色沉(chen)淀(dian)，可再次離心(xin)后取上(shang)(shang)清。
5． 小心地將(jiang)上清轉移到吸附柱CP中（吸(xi)附(fu)柱(zhu)放入收集(ji)管中），10,000g 離心30–60秒，倒(dao)掉收集管中的廢液，將吸附柱CP重新放回收(shou)集管(guan)中。
6． 向吸(xi)附柱CP中(zhong)加入700 μl漂(piao)洗(xi)液PW（請(qing)先檢查是否已(yi)加入(ru)無水(shui)乙醇），10,000g 離心30–60秒，倒掉收(shou)集管中的(de)廢液，將吸附柱CP重新放回收集管中。
7 向(xiang)吸附柱CP中(zhong)加(jia)入500
μl漂洗液(ye)PW，10,000g 離心30–60秒，倒掉收集管中的廢液。
8. 將吸(xi)附柱CP置(zhi)于收(shou)集管中，10,000g 離(li)心2分鐘(zhong)。
注：此步驟(zou)目的(de)是(shi)將(jiang)吸(xi)附(fu)柱中(zhong)殘(can)余的(de)漂洗液去除，絕對不可省略，因(yin)為漂洗液中(zhong)乙醇(chun)的(de)殘(can)留會影響后續實驗（酶切(qie)，PCR等）。
9． 將(jiang)吸附柱(zhu)CP置于一個干凈(jing)的1.5ml離(li)心管中，向吸附膜(mo)的中(zhong)央(yang)部位懸(xuan)空滴(di)加50–100
μl洗脫緩沖液EB，室溫(wen)放(fang)置2分鐘，10,000g離心2分鐘將質(zhi)粒(li)溶液收集到離心管中，-20℃保存。
注：● 為了增加質(zhi)粒的回(hui)收效率，可將得(de)到的洗脫液重新加入離(li)心(xin)吸(xi)附柱中，再次離(li)心(xin)收集。
● 洗(xi)脫緩沖液體積不應少于50 μl，體(ti)積過(guo)小影響回收效率。
● 洗脫液的pH值(zhi)對于洗(xi)脫效(xiao)率有很大(da)影響。若用水做洗(xi)脫液應保證(zheng)其pH值在(zai)7.0-8.5范圍內，pH值(zhi)低于(yu)7.0會降低(di)洗脫效(xiao)率。
質粒提取試劑盒 RTP2101/RTP2102發表文章
1. A weird DNA band in PCR and its cause.
Author: Chang Shenghe, Sun Wei, Zhou Zhaoxi, Li Jingyang, Dai Minjie, Shu Haiyan
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Journal of Plant Science & Molecular
Breeding Volume 5 Article 2 2016
Institution：Haikou
experimental station, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Paper link：
2. [2017 IF=4.076] Application of Real-Time Quantitative PCR
to Detect Mink Circovirus in Naturally and Experimentally Infected Minks.
Author: Xingyang Cui, Yunjia Shi, Lili Zhao, Shanshan Gu, Chengwei Wei, Yan
Yang,Shanshan Wen, Hongyan Chen and Junwei Ge
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Fronties in Microbiology May 2018 | Volume 9 | Article 937
Institution：College of
Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University
Paper link：
3. [2018 IF=8.063] ATF4 destabilizes RET through nonclassical
GRP78 inhibition to enhance chemosensitivity to bortezomib in human
osteosarcoma
Author: Jie Luo, Yuanzheng Xia, Yong Yin, Jun Luo, Mingming Liu, Hao Zhang, Chao
Zhang, Yucheng Zhao, Lei Yang, and Lingyi Kong
Product: RTP2101 高純質粒小提試劑盒
Journal: Theranostics 2019, Vol. 9, Issue 21
Institution：School of
Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University
Paper link：
4. [2020 IF=1.336] Isopentenyl Diphosphate Isomerase (IPI)
Gene Silencing Negatively Afects Patchouli Alcohol Biosynthesis
in Pogostemon cablin
Author: Wuping Yan,Yuzhang Yang,Yougen Wu,Jing Yu,Junfeng Zhang,
Dongmei Yang, Zeeshan Ul Haq Muhammad
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Plant Molecular Biology Reporter Published 27 January 2021
Institution：College
of Horticulture, Hainan University
Paper link：
5. [2022 IF=2] Genomic characterization and phylogenetic
analysis of Aleutian mink disease virus identified in a sudden death mink case
Author: Xingyang Cui, Yan Yang, Fang Wang, Jilong Luo, Ping Zhang, Hongyan Chen,
Lili Zhao, Junwei Ge
Product: RTP2102 普通質粒小提試劑盒
Journal: Comparative Immunology, Microbiology
and Infectious Diseases. Vo101, October 2023, 102052
Institution：College of
Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University
Paper link：