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Western一抗二抗去除液（酸性，溫和型(xing)）

● 產品簡介：

Western一(yi)抗(kang)(kang)(kang)二抗(kang)(kang)(kang)去除液（酸性，溫和(he)型）(Western Antibody Stripping Buffer，acid，mild type)可(ke)(ke)以(yi)(yi)高效去除印(yin)跡膜(mo)(mo)上的一(yi)抗(kang)(kang)(kang)和(he)二抗(kang)(kang)(kang)，而吸附(fu)在膜(mo)(mo)上的抗(kang)(kang)(kang)原基本(ben)(ben)不(bu)受(shou)影(ying)響，用于Western中(zhong)轉移了蛋(dan)白膜(mo)(mo)的重復利(li)用，可(ke)(ke)以(yi)(yi)轉一(yi)次膜(mo)(mo)，做(zuo)多(duo)次Western印(yin)跡實(shi)驗，通(tong)常可(ke)(ke)以(yi)(yi)重復利(li)用膜(mo)(mo)5-8次（PVDF膜(mo)(mo)）。使(shi)用本(ben)(ben)試劑只需大約20-30分鐘即可(ke)(ke)實(shi)現(xian)蛋(dan)白膜(mo)(mo)的重復使(shi)用，然后可(ke)(ke)以(yi)(yi)進行Western的后續操(cao)作。

該產品具有以(yi)下幾個優點：

1.可用于昂貴或珍稀樣本的多(duo)次(ci)雜(za)交；

2.有利(li)于用(yong)不(bu)同(tong)抗體分析單次印跡上(shang)的(de)不(bu)同(tong)蛋白，比如不(bu)同(tong)亞型的(de)抗體；

3.有利于對異常結(jie)果進(jin)行重新分析或確(que)認；

4.有利(li)于(yu)糾正孵錯的抗體；

5.節約試劑成本，并節約時(shi)間。

各種去除液的選擇請點擊Western一抗二抗去除液選擇指南。

● 貯存：

   4℃貯存，有效期一(yi)年；常溫運(yun)輸。

● 用前必讀：

1. 理想的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)去(qu)除(chu)液應該是洗脫(tuo)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)同(tong)時，不(bu)(bu)洗脫(tuo)膜(mo)(mo)上結合的(de)(de)(de)蛋白(bai)或者(zhe)不(bu)(bu)改變抗(kang)(kang)(kang)原的(de)(de)(de)結合性質，但是目前沒有一(yi)種去(qu)除(chu)液可以做(zuo)到(dao)只洗脫(tuo)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，而完全不(bu)(bu)洗脫(tuo)膜(mo)(mo)上結合的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)原；也(ye)(ye)沒有一(yi)種去(qu)除(chu)液可以適(shi)用(yong)于所有不(bu)(bu)同(tong)親和度的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)原抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)復(fu)合物(wu)。去(qu)除(chu)液洗脫(tuo)能力太強，抗(kang)(kang)(kang)原也(ye)(ye)容(rong)易被洗脫(tuo)；太弱，則抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)殘留太高。因此，從免疫(yi)印跡膜(mo)(mo)上去(qu)除(chu)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)方案僅能用(yong)于定性用(yong)途，因為在每個抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)清除(chu)循環(huan)中，或多或少(shao)都(dou)將(jiang)洗去(qu)少(shao)量膜(mo)(mo)上的(de)(de)(de)蛋白(bai)。

2. PVDF膜比硝酸纖維(wei)素膜（NC膜）更堅韌(ren)，因(yin)此(ci)優先推(tui)薦(jian)使用(yong)PVDF膜用(yong)于(yu)涉及(ji)抗體剝(bo)離的實(shi)驗。

3. 從SDS-PAGE凝膠轉印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白質與膜的結合，特別推薦用于涉及多次抗體剝離的實驗。在第一輪抗體檢測之前，必須使用甲醇將干燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST將干燥的NC膜潤濕。已經結合有抗體的膜，決不能使得膜干燥，否則抗體分子將與膜結合緊密，很難剝離。因此，在做完一輪(lun)ECL發光檢測實(shi)驗后(hou)，需要用清(qing)除(chu)液清(qing)除(chu)掉膜(mo)上的抗體，推薦將膜(mo)浸泡(pao)于1×TBS（非1×TBST）中4度保存(cun)。

4. 檢測時，優(you)先檢測低(di)豐(feng)度抗原：先孵(fu)育(yu)條帶較(jiao)弱（表(biao)達較(jiao)低(di)）的蛋白(bai)，再孵(fu)育(yu)條帶明顯（表(biao)達較(jiao)高）的蛋白(bai)，最后再孵(fu)育(yu)內參。

5. 如條件(jian)允許，下一(yi)輪的(de)(de)抗(kang)體雜交實(shi)驗(yan)選(xuan)擇種屬來(lai)源(yuan)不(bu)同的(de)(de)一(yi)抗(kang)（對應(ying)不(bu)同種屬的(de)(de)二抗(kang)），減少(shao)檢測(ce)的(de)(de)交叉反(fan)應(ying)。

 6. 該清除液(ye)適用(yong)于ECL發光檢測的膜上抗體清除，不適合于膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不適合熒(ying)光檢測。

● 使用說明：

1. 在完成Western化(hua)學發光檢測后，NC膜或PVDF膜用(yong)適量蒸(zheng)餾水中(zhong)震蕩(dang)漂(piao)洗(xi)5分鐘(zhong)；重復(fu)漂(piao)洗(xi)2次。

2. 棄(qi)蒸餾水，加入適量的Western一(yi)抗(kang)二抗(kang)去除液，常(chang)溫（25℃）在搖床上震蕩漂洗(xi)20-30分鐘(zhong)（轉(zhuan)速70 -80 rpm）。 孵(fu)育溫度和(he)時間會明顯影響(xiang)抗(kang)體去除效果，參(can)照下表調整(zheng)。

3. 棄(qi)去除液，加入(ru)足量蒸(zheng)餾水(shui)，在搖床上漂(piao)(piao)洗(xi)2次(ci)(ci)，每(mei)次(ci)(ci)5分鐘，把去除液徹底漂(piao)(piao)洗(xi)干凈。

  注：殘(can)余的(de)(de)去(qu)除(chu)液會影(ying)響(xiang)后續抗(kang)(kang)原抗(kang)(kang)體的(de)(de)的(de)(de)結合。

4. 可選步驟(zou)：漂洗后的轉印膜(mo)(mo)孵育(yu)ECL發光液，檢測二(er)抗的清(qing)除效率。曝光5分鐘，膜(mo)(mo)上看不到發光條帶表明(ming)二(er)抗清(qing)除得比較(jiao)干凈。如(ru)果膜(mo)(mo)上能看到條帶，重復步驟(zou)2-3。

5．繼續進(jin)行Western的(de)后(hou)續操作（封閉-抗體孵(fu)育(yu)-發光檢測）。

● 實驗示(shi)例：

Western一抗二抗去除液(ye)（酸性，溫和型）檢測效果圖

樣品(pin)：K562細胞(bao)，SDS裂解液（貨(huo)號(hao)：RL1060）提取總蛋(dan)白(bai)

電泳(yong)條件：12% RealPAGE預制膠（貨(huo)號:RTD6117-0012） 150 V 1×TGS  80 min

轉膜條件：PVDF膜 孔徑0.45μm，1×RealBlot快速轉膜液（貨號(hao)：RT5020） 恒流350 mA 35 min

封(feng)閉：無蛋白(bai)快速(su)封(feng)閉液（貨號：PF1070）常溫25℃搖床慢搖10 min

抗(kang)體去(qu)除(chu)步驟：膜蒸(zheng)餾水漂洗3次，加入5 ml Western一抗(kang)二(er)抗(kang)去(qu)除(chu)液（酸性，溫和型），常溫25℃，

搖(yao)床慢搖(yao) 20 min

圖1：一抗(kang)：PCNA鼠單抗(kang) 1:5000 ，常溫60 min孵育，羊抗(kang)鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光2秒。

圖2：膜第1次(ci)(ci)清除后抗體去(qu)(qu)除效果檢(jian)測：膜水漂洗3次(ci)(ci)，TBST漂洗1次(ci)(ci)，ECL曝光5分鐘，膜上(shang)幾乎無可見條(tiao)帶，說(shuo)明(ming)二抗去(qu)(qu)除干(gan)凈。

圖3：膜第1次清除(chu)后，GAPDH檢測： GAPDH兔多抗 1:3000  RT 60 min孵育(yu)，羊(yang)抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光(guang)30秒。

圖(tu)4：膜第2次清除后，H3檢(jian)測： H3鼠單抗(kang) 1:10000  RT  60 min孵(fu)(fu)育，羊抗(kang)鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵(fu)(fu)育，ECL曝光3秒。

圖5：膜第(di)3次清除后，β-Actin檢測：β-Actin鼠(shu)單抗(kang)(kang) 1:5000  RT  60 min孵育，羊(yang)抗(kang)(kang)鼠(shu)IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光29秒。

圖6：膜第4次(ci)清(qing)除后，PCNA檢測(ce)：PCNA鼠單抗 1:5000  RT  60 min孵(fu)育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵(fu)育，ECL曝光2秒。