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Western一抗(kang)二抗(kang)去除(chu)液（強堿，劇烈型）

● 產品簡介：

Western一抗二抗去除(chu)液(ye)（強堿，劇(ju)烈型）(Western Antibody Stripping Buffer，basic，harsh type)可以高效去除(chu)印(yin)(yin)跡(ji)(ji)膜(mo)(mo)上(shang)的(de)一抗和二抗，而(er)吸附在膜(mo)(mo)上(shang)的(de)抗原基本不受影響，用(yong)(yong)(yong)于(yu)Western中轉移了(le)蛋白膜(mo)(mo)的(de)重復(fu)利(li)用(yong)(yong)(yong)，可以轉一次膜(mo)(mo)，做多次Western印(yin)(yin)跡(ji)(ji)實(shi)驗，通常(chang)可以重復(fu)利(li)用(yong)(yong)(yong)膜(mo)(mo)3-5（PVDF膜(mo)(mo)）。使用(yong)(yong)(yong)本試劑(ji)只需大約(yue)5-10分(fen)鐘（NC膜(mo)(mo)）或15-20分(fen)鐘（PVDF膜(mo)(mo)）即(ji)可實(shi)現蛋白膜(mo)(mo)的(de)重復(fu)使用(yong)(yong)(yong)，然后(hou)(hou)可以進(jin)行Western的(de)后(hou)(hou)續操作。

該產品(pin)具有(you)以下幾(ji)個(ge)優點(dian)：

1.可用于(yu)昂貴或珍稀樣本(ben)的(de)多次雜交；

2.有(you)利于用不同抗體(ti)分析單次(ci)印跡上的不同蛋白，比如不同亞(ya)型的抗體(ti)；

3.有利于對異(yi)常結果(guo)進行重新分析或(huo)確認(ren)；

4.有利于糾正(zheng)孵錯(cuo)的(de)抗體；

5.節約試劑(ji)成(cheng)本，并節約時(shi)間(jian)。

各種去除液的選擇請點擊Western一抗二抗去除液選擇指南。

● 貯(zhu)存：

   常溫貯存，有效期(qi)一年；常溫運輸。

● 用前必讀：

1. 理想的(de)(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)去(qu)(qu)除液應該是(shi)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)同(tong)時，不洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)膜(mo)上(shang)(shang)結(jie)合(he)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)或(huo)者不改(gai)變(bian)抗(kang)(kang)原(yuan)的(de)(de)結(jie)合(he)性(xing)質，但是(shi)目(mu)前沒有(you)一種(zhong)去(qu)(qu)除液可以做到(dao)只洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)，而完全不洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)膜(mo)上(shang)(shang)結(jie)合(he)的(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)；也(ye)沒有(you)一種(zhong)去(qu)(qu)除液可以適用(yong)于所有(you)不同(tong)親和度(du)的(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)復合(he)物。去(qu)(qu)除液洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)能力(li)太強，抗(kang)(kang)原(yuan)也(ye)容易被(bei)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)；太弱，則抗(kang)(kang)體(ti)(ti)殘留太高。因此，從免疫印跡膜(mo)上(shang)(shang)去(qu)(qu)除抗(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)方案僅能用(yong)于定性(xing)用(yong)途，因為(wei)在每(mei)個抗(kang)(kang)體(ti)(ti)清除循環(huan)中(zhong)，或(huo)多(duo)或(huo)少(shao)都將洗(xi)(xi)去(qu)(qu)少(shao)量膜(mo)上(shang)(shang)的(de)(de)蛋(dan)白(bai)。

2. PVDF膜(mo)比(bi)硝酸纖維素膜(mo)（NC膜(mo)）更堅韌，因此優先(xian)推(tui)薦使用PVDF膜(mo)用于涉及(ji)抗體剝(bo)離的實驗。

3. 從SDS-PAGE凝膠轉印(yin)完成后立(li)即干燥PVDF膜或NC膜，可改(gai)善蛋白質與膜的(de)結合，特別推薦用于涉及多(duo)次抗體(ti)剝離的(de)實驗。在第一輪抗體(ti)檢測之前，必須使用甲醇將干燥的(de)PVDF膜潤(run)濕(shi)或用1×TBST將干燥的(de)NC膜潤(run)濕(shi)。已(yi)經(jing)結(jie)合有抗(kang)(kang)體的(de)膜，決不(bu)能使得膜干(gan)燥，否則抗(kang)(kang)體分(fen)子(zi)將(jiang)與膜結(jie)合緊密，很難剝離。因此，在做(zuo)完一輪ECL發光檢測實驗后，需(xu)要用(yong)清(qing)除液清(qing)除掉膜上的(de)抗體，推薦(jian)將膜浸泡于1×TBS（非(fei)1×TBST）中(zhong)4度保存。

4. 檢測(ce)時，優先檢測(ce)低(di)豐度抗原：先孵(fu)育條帶(dai)較弱（表達較低(di)）的(de)蛋白(bai)，再(zai)(zai)孵(fu)育條帶(dai)明顯（表達較高）的(de)蛋白(bai)，最后再(zai)(zai)孵(fu)育內參(can)。

5. 如條件允許，下(xia)一輪(lun)的抗體(ti)雜交實驗(yan)選擇種屬(shu)來源(yuan)不同的一抗（對應(ying)不同種屬(shu)的二抗），減少檢測的交叉(cha)反應(ying)。

6. 該清除(chu)(chu)液(ye)適用于(yu)ECL發光(guang)檢測(ce)的膜上抗體清除(chu)(chu)，不適合于(yu)膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等(deng)），不適合熒(ying)光(guang)檢測(ce)。

● 使用說(shuo)明(ming)：

1. 在(zai)完成Western化(hua)學發光(guang)檢測后(hou)，NC膜或(huo)PVDF膜用適量(liang)蒸餾水中震蕩漂(piao)洗5分鐘；重復漂(piao)洗2次。

2. 棄蒸餾水(shui)，加入適量的Western一抗(kang)二抗(kang)去除液，在(zai)搖床(chuang)上震蕩漂洗(xi)清除抗(kang)體。

孵育溫度(du)和時間會明顯影響抗(kang)體去除效果，參照下表調整。

3. 棄去除(chu)液，加入足(zu)量(liang)蒸餾水，在(zai)搖(yao)床上漂(piao)洗(xi)2次(ci)，每次(ci)5分鐘，把去除(chu)液徹(che)底漂(piao)洗(xi)干(gan)凈。

  注：殘余(yu)的(de)去除液(ye)會影響后續(xu)抗(kang)原抗(kang)體的(de)的(de)結(jie)合。

4. 可選(xuan)步(bu)驟(zou)：漂洗后(hou)的轉印膜孵育ECL發光(guang)液，檢測二抗(kang)的清除效率。曝光(guang)5分(fen)鐘，膜上(shang)看不到發光(guang)條帶表(biao)明(ming)二抗(kang)清除得比較干凈。如(ru)果(guo)膜上(shang)能看到條帶，重復步(bu)驟(zou)2-3。

5．繼續(xu)(xu)進(jin)行Western的后續(xu)(xu)操作(zuo)（封閉-抗體孵育-發光檢(jian)測）。

   注(zhu)：建(jian)議(yi)每次膜剝離后都要進行重(zhong)新封閉(bi)，以降低背景(jing)。優先選用(yong)(yong)5%脫脂奶粉（貨號：WN1070）封閉(bi)，推(tui)薦常溫封閉(bi)1小時；使用(yong)(yong)Western無蛋白(bai)快(kuai)速封閉(bi)液(ye)（貨號：PF1070）時，NC膜需要封閉(bi)60分鐘；PVDF膜可以封閉(bi)10分鐘。

● 實驗示例(li)：

Western一抗(kang)二抗(kang)去除液（堿(jian)性(xing)，劇烈(lie)型）檢測效(xiao)果(guo)圖

Western一抗(kang)二抗(kang)清除液（堿(jian)性，劇(ju)烈型）檢測效果圖

樣(yang)品：K562細胞，SDS裂(lie)解液（貨(huo)號：RL1060）提取總蛋白；

電泳：4-20% RealPAGE預制膠（貨(huo)號:RTD6117-0420）， 200 V 1×TGS  56 min

轉膜：NC膜，1×RealBlot快速轉膜液（貨號：RT5020）400 mA 40 min

圖1：5%脫(tuo)脂奶粉封閉液（貨號：WN1070）  RT  60 min；一抗(kang)(kang)：Santa β-Actin鼠(shu)單抗(kang)(kang)（SC-47778） 1:2000  RT 60min；二抗(kang)(kang)：羊抗(kang)(kang)鼠(shu)IgG-HRP 1:5000（貨號：HGM1060）  RT 60min；ECL自動(dong)曝光3秒(miao)

圖2：膜加入Western一抗(kang)(kang)二(er)抗(kang)(kang)清除液（堿(jian)性，劇烈(lie)型(xing)），第1次清除，常溫25度，搖床5 min，ECL自動(dong)曝光5分(fen)鐘，膜上二(er)抗(kang)(kang)條(tiao)帶(dai)去除干凈。

圖3：5%脫脂(zhi)奶(nai)粉封閉液（貨號(hao)：WN1070），常(chang)溫(wen)搖(yao)床60分鐘，PCNA 1:5000（貨號(hao)：APM5012）  RT 60min，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 （貨號(hao)：HGM1060）RT 60min，自動曝光11秒，β-actin和PCNA同時有條帶，說明圖二(er)中(zhong)actin一抗沒(mei)有完全去除干凈。

圖4：膜加(jia)入Western一(yi)抗(kang)二抗(kang)清除(chu)液（堿性(xing)，劇烈(lie)型），常溫24度 5 min第2次(ci)清除(chu)抗(kang)體，

Western無蛋白快速(su)封閉(bi)液（貨號；PF1070）RT 60分鐘，一抗：Santa β-Actin鼠單(dan)抗（SC-47778） 1:4000 RT 60min，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（貨號：HGM1060）  RT 60min；ECL自動曝(pu)光6秒。

圖5：膜加入Western一抗二抗清除液（堿(jian)性，劇烈型）第3次清除 26度 5min，

一抗(kang)：Santa β-Actin鼠單抗(kang)（SC-47778） 1:4000  RT 60min；

二抗(kang)：羊抗(kang)鼠IgG-HRP 1:5000（貨號：HGM1060）  RT 60min；ECL自動曝光3分鐘(zhong)。