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Western一抗(kang)二抗(kang)去除(chu)液（弱堿，溫和型）

● 產品簡(jian)介：

Western一(yi)抗(kang)二(er)抗(kang)去(qu)除液（弱堿，溫(wen)和型）(Western Antibody Stripping Buffer，weak alkaline，mild type)可(ke)(ke)以高效去(qu)除印跡膜(mo)上(shang)的一(yi)抗(kang)和二(er)抗(kang)，而吸附在膜(mo)上(shang)的抗(kang)原基(ji)本(ben)不受(shou)影響，用(yong)于Western中轉移了蛋白膜(mo)的重復利(li)用(yong)，可(ke)(ke)以轉一(yi)次(ci)膜(mo)，做多次(ci)Western印跡實驗，通常(chang)可(ke)(ke)以重復利(li)用(yong)膜(mo)5-8次(ci)（PVDF膜(mo)）。使(shi)用(yong)本(ben)試劑只(zhi)需(xu)大約30分鐘即(ji)可(ke)(ke)實現蛋白膜(mo)的重復使(shi)用(yong)，然后可(ke)(ke)以進行(xing)Western的后續操(cao)作。

該(gai)產品具(ju)有以下幾個優點(dian)：

1.可(ke)用于昂貴或(huo)珍稀樣本的多次(ci)雜交；

2.有利于用不同(tong)抗體分析單(dan)次印(yin)跡上的不同(tong)蛋白，比如不同(tong)亞型的抗體；

3.有利于(yu)對異常(chang)結(jie)果進行重新分(fen)析或確(que)認；

4.有利于糾(jiu)正孵錯的(de)抗體；

5.節約試劑成(cheng)本，并節約時間(jian)。

各種去除液的選擇請點擊Western一抗二抗去除液選擇指南。

● 貯存：

   常(chang)溫貯存，有(you)效期(qi)一年；常(chang)溫運輸。

● 用前必(bi)讀：

1. 理(li)想的(de)(de)抗(kang)體去(qu)(qu)除(chu)(chu)液應該是(shi)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)抗(kang)體的(de)(de)同時，不洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)膜(mo)上結合(he)的(de)(de)蛋白或(huo)(huo)者不改變(bian)抗(kang)原(yuan)(yuan)的(de)(de)結合(he)性質，但是(shi)目前沒有(you)一種去(qu)(qu)除(chu)(chu)液可(ke)(ke)以(yi)做到只(zhi)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)抗(kang)體，而(er)完全不洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)膜(mo)上結合(he)的(de)(de)抗(kang)原(yuan)(yuan)；也沒有(you)一種去(qu)(qu)除(chu)(chu)液可(ke)(ke)以(yi)適用(yong)于所有(you)不同親和度(du)的(de)(de)抗(kang)原(yuan)(yuan)抗(kang)體復合(he)物。去(qu)(qu)除(chu)(chu)液洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)能力太(tai)強，抗(kang)原(yuan)(yuan)也容易被(bei)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)；太(tai)弱，則抗(kang)體殘留太(tai)高。因此，從免疫印跡(ji)膜(mo)上去(qu)(qu)除(chu)(chu)抗(kang)體的(de)(de)方案僅能用(yong)于定性用(yong)途，因為(wei)在每個抗(kang)體清除(chu)(chu)循(xun)環(huan)中，或(huo)(huo)多或(huo)(huo)少都將(jiang)洗(xi)(xi)去(qu)(qu)少量膜(mo)上的(de)(de)蛋白。

2. PVDF膜(mo)比(bi)硝酸(suan)纖維素膜(mo)（NC膜(mo)）更堅(jian)韌(ren)，因此優先推薦使用PVDF膜(mo)用于(yu)涉(she)及(ji)抗體剝離的實驗。

3. 從SDS-PAGE凝(ning)膠轉印(yin)完成后(hou)立即干燥PVDF膜(mo)(mo)或NC膜(mo)(mo)，可改善蛋(dan)白質與膜(mo)(mo)的(de)結合，特別(bie)推(tui)薦用于涉及多(duo)次抗體剝離的(de)實(shi)驗。在第一輪抗體檢測(ce)之(zhi)前，必須(xu)使用甲醇將干燥的(de)PVDF膜(mo)(mo)潤(run)濕或用1×TBST將干燥的(de)NC膜(mo)(mo)潤(run)濕。已(yi)經結合有(you)抗(kang)體的膜(mo)(mo)，決不能(neng)使得膜(mo)(mo)干燥，否(fou)則抗(kang)體分(fen)子將與(yu)膜(mo)(mo)結合緊密，很難剝(bo)離(li)。因此，在(zai)做完一輪(lun)ECL發光檢測實(shi)驗后，需要(yao)用清(qing)(qing)除(chu)液(ye)清(qing)(qing)除(chu)掉膜上(shang)的抗(kang)體，推薦(jian)將(jiang)膜浸泡(pao)于(yu)1×TBS（非1×TBST）中(zhong)4度保存。

4. 檢測時，優先(xian)檢測低豐(feng)度抗原：先(xian)孵育條(tiao)帶較(jiao)弱（表達較(jiao)低）的(de)蛋白(bai)，再(zai)(zai)孵育條(tiao)帶明顯（表達較(jiao)高(gao)）的(de)蛋白(bai)，最后再(zai)(zai)孵育內(nei)參。

5. 如條件允(yun)許，下(xia)一輪(lun)的(de)抗(kang)體雜交實驗選擇種(zhong)屬(shu)來源不同的(de)一抗(kang)（對應(ying)不同種(zhong)屬(shu)的(de)二抗(kang)），減少檢測的(de)交叉(cha)反應(ying)。

6. 該清(qing)除液適(shi)用(yong)于(yu)ECL發光(guang)(guang)檢測的膜上抗體清(qing)除，不適(shi)合(he)于(yu)膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不適(shi)合(he)熒光(guang)(guang)檢測。

● 使用說明：

1. 在(zai)完成Western化(hua)學發光檢測后，NC膜或(huo)PVDF膜用適量蒸餾水中震蕩(dang)漂洗5分鐘；重復漂洗2次。

2. 棄(qi)蒸(zheng)餾水，加入適量(liang)的Western一抗(kang)二抗(kang)去除液，根據下表(biao)操(cao)作。孵育溫度和時間(jian)會明顯(xian)影響抗(kang)體去除效(xiao)果，參照下表(biao)調整。

3. 棄去(qu)除(chu)液，加入足(zu)量蒸(zheng)餾水，在搖床上漂(piao)洗2次，每(mei)次5分鐘，把去(qu)除(chu)液徹底漂(piao)洗干(gan)凈。

  注：殘(can)余的去除液會(hui)影(ying)響(xiang)后續抗原抗體的的結合。

4. 可選步驟：漂洗后的轉印膜孵育ECL發光(guang)液(ye)，檢(jian)測(ce)二抗的清(qing)除效率。曝光(guang)5-10分鐘(zhong)，膜上看不到(dao)發光(guang)條帶表明二抗清(qing)除得(de)比較(jiao)干(gan)凈。如果(guo)膜上能看到(dao)條帶，重復步驟2-3。

5．繼(ji)續進行Western的后續操作（封閉-抗體孵(fu)育-發(fa)光檢測）。

   注：建議每(mei)次膜剝(bo)離后都要(yao)進行重新封閉，以降低背景。

● 實(shi)驗示(shi)例：

樣(yang)品：K562細(xi)胞,SDS裂解液（貨號(hao)：RL1060）提取(qu)總蛋(dan)白；

電(dian)泳：4-20% RealPAGE預制膠（貨號：RTD6117-0420）電(dian)泳

轉(zhuan)(zhuan)膜(mo)：NC膜(mo)，1×RealBlot快速(su)轉(zhuan)(zhuan)膜(mo)液(ye)（貨號：RT5020）快速(su)濕(shi)轉(zhuan)(zhuan)，恒流400 mA 30 min

圖1：Western快(kuai)速封閉液（貨號：WR5020）RT 快(kuai)封  15 min；一抗：β-Actin鼠單抗 1:10000  RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min；ECL（貨號：EC2520）曝(pu)光1秒(miao)。

圖2： Western一抗二抗去(qu)除液(ye)（弱堿(jian)，溫和型） RT 20分鐘(zhong)(zhong)剝離，ECL曝光11分鐘(zhong)(zhong)，二抗去(qu)除干凈。

圖3： Western快速封閉液（貨(huo)號(hao)：WR5020）RT 快封20分鐘；一抗：PCNA鼠單抗1：5000 RT 60min，二抗羊抗鼠IgG-HRP 1:5000，ECL（貨(huo)號(hao)：EC2520）曝(pu)光1秒(miao)。

圖(tu)4： 膜(mo)第二次剝離RT 30分鐘(zhong)，ECL自動曝光11min ，二抗(kang)去除干(gan)凈

圖5： Western快(kuai)速封閉液（貨號：WR5020）RT 快(kuai)封30min；一抗(kang)：GAPDH兔多抗(kang) 1:3000 60min，二(er)抗(kang)：羊抗(kang)兔IgG-HRP RT 60min，ECL曝光2分16秒。

Western一抗(kang)二(er)抗(kang)去(qu)除液（弱堿，溫和型） PVDF膜(mo)測試(shi)

樣品：K562細胞,SDS裂解(jie)液(貨(huo)號：RL1060)提取總蛋白

電(dian)泳條件：12% RealPAGE預制膠（貨(huo)號：RTD6117-0012）， 恒壓150 V 1×TGS  73 min

轉膜(mo)(mo)條(tiao)件：PVDF膜(mo)(mo) 孔徑0.45μm，1×RealBlot快速轉膜(mo)(mo)液（貨號：RT5020） 恒(heng)流400 mA 30 min

封(feng)(feng)閉(bi)：無蛋白快(kuai)速封(feng)(feng)閉(bi)液（貨號：PF1070）常溫(wen)封(feng)(feng)閉(bi)10 min

膜去除抗(kang)體程(cheng)序：37度，搖床(chuang)60rpm 10分鐘

圖1：一抗：PCNA鼠單抗 1:5000，RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光1秒(miao)

圖2：膜第1次(ci)清除后抗(kang)(kang)(kang)體去除效果檢測：膜水漂洗3次(ci)，加入5 ml抗(kang)(kang)(kang)體去除液去除抗(kang)(kang)(kang)體，TBST漂洗3次(ci)，ECL曝光(guang)5分鐘(zhong)，膜上幾乎無可(ke)見條(tiao)帶，說明二抗(kang)(kang)(kang)去除干凈。

圖3：膜第1次清(qing)除后，H3檢測(ce)： H3鼠單抗 1:10000  RT  60 min孵(fu)(fu)育(yu)，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵(fu)(fu)育(yu)，ECL曝光(guang)5秒。

圖4：膜第(di)2次清除后，GAPDH檢測： GAPDH兔多抗 1:3000  RT 60 min孵育，羊抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光150秒。

圖(tu)5：膜第3次(ci)清(qing)除后，PCNA檢測(ce)：PCNA鼠(shu)單抗 1:5000  RT  60 min孵育，羊(yang)抗鼠(shu)IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝(pu)光1秒。