Western一抗二(er)抗去(qu)除液（弱堿，溫和型(xing)）
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貨號
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名稱
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規(gui)格
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WS1200-100ml
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Western一抗(kang)二抗(kang)去除(chu)液(ye)（弱堿，溫和型）
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100 ml
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WS1200-500ml
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Western一抗二抗去除液（弱堿(jian)，溫(wen)和型）
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500 ml
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● 產(chan)品簡介：
Western一(yi)(yi)抗(kang)二(er)抗(kang)去除液（弱堿，溫和型）(Western Antibody Stripping Buffer，weak alkaline，mild type)可(ke)(ke)以(yi)高效去除印跡膜(mo)上的(de)一(yi)(yi)抗(kang)和二(er)抗(kang)，而吸附在膜(mo)上的(de)抗(kang)原基本不受(shou)影響，用(yong)(yong)于Western中轉移了(le)蛋白(bai)膜(mo)的(de)重(zhong)(zhong)復利用(yong)(yong)，可(ke)(ke)以(yi)轉一(yi)(yi)次膜(mo)，做多(duo)次Western印跡實驗，通常可(ke)(ke)以(yi)重(zhong)(zhong)復利用(yong)(yong)膜(mo)5-8次（PVDF膜(mo)）。使(shi)用(yong)(yong)本試劑只需大約30分(fen)鐘即可(ke)(ke)實現(xian)蛋白(bai)膜(mo)的(de)重(zhong)(zhong)復使(shi)用(yong)(yong)，然(ran)后(hou)可(ke)(ke)以(yi)進行Western的(de)后(hou)續操作。
該(gai)產品具有以下幾個(ge)優點(dian)：
1.可用于昂貴或珍稀(xi)樣(yang)本(ben)的(de)多次雜交；
2.有利于用不同抗體(ti)分析單次印跡上(shang)的不同蛋(dan)白，比如不同亞型的抗體(ti)；
3.有(you)利于對異(yi)常結果進行重新分(fen)析或確認；
4.有(you)利(li)于糾(jiu)正孵錯的抗體；
5.節(jie)約試劑(ji)成本，并節(jie)約時間。
各種去除液的選擇請點擊Western一抗二抗去除液選擇指南。
● 貯存：
常溫貯(zhu)存，有效期一(yi)年；常溫運輸。
● 用(yong)前必讀：
1. 理(li)想的(de)(de)抗(kang)體(ti)(ti)去(qu)除(chu)液(ye)應該(gai)是洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)抗(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)同(tong)時(shi)，不(bu)(bu)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)膜(mo)上(shang)(shang)結(jie)合(he)(he)(he)的(de)(de)蛋白或(huo)者不(bu)(bu)改(gai)變抗(kang)原的(de)(de)結(jie)合(he)(he)(he)性質，但是目前(qian)沒(mei)(mei)有一(yi)種(zhong)去(qu)除(chu)液(ye)可(ke)以做到只(zhi)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)抗(kang)體(ti)(ti)，而完(wan)全(quan)不(bu)(bu)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)膜(mo)上(shang)(shang)結(jie)合(he)(he)(he)的(de)(de)抗(kang)原；也沒(mei)(mei)有一(yi)種(zhong)去(qu)除(chu)液(ye)可(ke)以適用(yong)于所有不(bu)(bu)同(tong)親(qin)和度的(de)(de)抗(kang)原抗(kang)體(ti)(ti)復合(he)(he)(he)物。去(qu)除(chu)液(ye)洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)能力太(tai)強(qiang)，抗(kang)原也容易被洗(xi)(xi)脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)；太(tai)弱，則抗(kang)體(ti)(ti)殘(can)留太(tai)高。因此，從免疫印跡(ji)膜(mo)上(shang)(shang)去(qu)除(chu)抗(kang)體(ti)(ti)的(de)(de)方案僅能用(yong)于定性用(yong)途，因為在(zai)每個抗(kang)體(ti)(ti)清除(chu)循環中，或(huo)多或(huo)少都將洗(xi)(xi)去(qu)少量膜(mo)上(shang)(shang)的(de)(de)蛋白。
2. PVDF膜(mo)比硝酸纖維素膜(mo)（NC膜(mo)）更堅韌(ren)，因此(ci)優先(xian)推薦(jian)使用(yong)PVDF膜(mo)用(yong)于涉(she)及抗體(ti)剝離的(de)實驗。
3. 從SDS-PAGE凝膠轉印完成后立(li)即干(gan)燥PVDF膜(mo)(mo)(mo)或NC膜(mo)(mo)(mo)，可改善(shan)蛋白質與膜(mo)(mo)(mo)的結(jie)合，特別推薦用(yong)(yong)于涉及(ji)多次抗(kang)體剝(bo)離(li)的實驗。在第一輪抗(kang)體檢測之前，必須(xu)使(shi)用(yong)(yong)甲醇將(jiang)(jiang)干(gan)燥的PVDF膜(mo)(mo)(mo)潤濕或用(yong)(yong)1×TBST將(jiang)(jiang)干(gan)燥的NC膜(mo)(mo)(mo)潤濕。已經(jing)結合有抗體(ti)(ti)的膜，決不能使得(de)膜干燥(zao)，否則抗體(ti)(ti)分子將與膜結合緊密，很難(nan)剝離。因(yin)此(ci)，在做(zuo)完(wan)一輪ECL發光檢測(ce)實驗后，需(xu)要(yao)用(yong)清除液(ye)清除掉膜上的抗體，推薦將膜浸(jin)泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。
4. 檢測時(shi)，優先(xian)檢測低豐度抗原：先(xian)孵育條帶較(jiao)弱（表達較(jiao)低）的蛋白(bai)，再孵育條帶明顯(xian)（表達較(jiao)高）的蛋白(bai)，最(zui)后再孵育內參。
5. 如(ru)條件(jian)允許，下一輪的抗體雜交實驗選擇種(zhong)屬來源不同(tong)的一抗（對應不同(tong)種(zhong)屬的二抗），減少(shao)檢(jian)測(ce)的交叉反應。
6. 該清除(chu)液(ye)適(shi)用于ECL發光檢(jian)測(ce)的(de)膜上抗(kang)體清除(chu)，不適(shi)合于膜上直(zhi)接顯(xian)色（DAB，BCIP/NBT等），不適(shi)合熒光檢(jian)測(ce)。
● 使用說明：
1. 在(zai)完成Western化學發(fa)光檢測后，NC膜或PVDF膜用適(shi)量蒸餾(liu)水中震蕩漂洗5分鐘；重復漂洗2次(ci)。
2. 棄蒸餾水，加(jia)入適量的Western一(yi)抗二(er)抗去(qu)除液(ye)，根據下表操作(zuo)。孵育溫度(du)和(he)時間會(hui)明顯(xian)影(ying)響抗體去(qu)除效果(guo)，參照下表調整。
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操作溫(wen)度(du)
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震(zhen)蕩(dang)清除時間(jian)
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備注
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18℃
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30分鐘(zhong)以上
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冬天實驗室(shi)氣溫低時(shi)
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25℃
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~30 分鐘
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常規樣品(pin)操(cao)作
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推薦37℃
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10-25分鐘
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膜上蛋(dan)白含量高(gao)的(de)樣品或(huo)清除與(yu)膜親和力高(gao)的(de)抗體
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3. 棄去除(chu)液，加(jia)入(ru)足量蒸餾水，在(zai)搖床(chuang)上漂洗2次，每次5分鐘，把(ba)去除(chu)液徹(che)底(di)漂洗干凈。
注：殘余的去(qu)除液(ye)會影響(xiang)后續抗原抗體的的結合。
4. 可選步驟：漂洗后(hou)的轉印膜(mo)孵育ECL發光液，檢(jian)測二(er)抗的清除效率。曝光5-10分鐘，膜(mo)上看不到發光條帶表明(ming)二(er)抗清除得比較干凈。如果(guo)膜(mo)上能(neng)看到條帶，重復步驟2-3。
5．繼續進(jin)行Western的(de)后續操(cao)作（封閉-抗體孵育-發光(guang)檢測）。
注：建(jian)議每次膜(mo)剝離后都要進行重新封閉，以降低背景。
● 實驗示例：
樣(yang)品：K562細胞,SDS裂解(jie)液(ye)（貨號：RL1060）提取總蛋白；
電泳：4-20% RealPAGE預(yu)制膠(jiao)（貨號：RTD6117-0420）電泳
轉(zhuan)膜(mo)(mo)：NC膜(mo)(mo)，1×RealBlot快速(su)轉(zhuan)膜(mo)(mo)液（貨號：RT5020）快速(su)濕(shi)轉(zhuan)，恒流400 mA 30 min
圖1：Western快速(su)封閉液（貨號：WR5020）RT 快封 15 min；一抗：β-Actin鼠(shu)單抗 1:10000 RT 60min；二抗：羊抗鼠(shu)IgG-HRP 1:5000 RT 60min；ECL（貨號：EC2520）曝光1秒。
圖2： Western一抗二抗去(qu)除(chu)液（弱堿，溫和(he)型） RT 20分(fen)鐘(zhong)剝離，ECL曝光11分(fen)鐘(zhong)，二抗去(qu)除(chu)干凈。
圖(tu)3： Western快(kuai)速封(feng)閉(bi)液（貨號：WR5020）RT 快(kuai)封(feng)20分鐘；一抗(kang)：PCNA鼠單抗(kang)1：5000 RT 60min，二抗(kang)羊抗(kang)鼠IgG-HRP 1:5000，ECL（貨號：EC2520）曝光1秒(miao)。
圖4： 膜第二次剝離RT 30分鐘，ECL自動曝光11min ，二抗去除干(gan)凈
圖5： Western快速封(feng)閉液（貨號(hao)：WR5020）RT 快封(feng)30min；一抗(kang)：GAPDH兔多抗(kang) 1:3000 60min，二抗(kang)：羊(yang)抗(kang)兔IgG-HRP RT 60min，ECL曝光2分16秒(miao)。
Western一抗二(er)抗去除(chu)液（弱堿(jian)，溫和型） PVDF膜測試
樣品：K562細胞,SDS裂解液(貨號(hao)：RL1060)提取總蛋白
電泳條件：12% RealPAGE預(yu)制膠（貨(huo)號：RTD6117-0012）， 恒(heng)壓150 V 1×TGS 73 min
轉(zhuan)膜條件(jian)：PVDF膜 孔(kong)徑0.45μm，1×RealBlot快(kuai)速轉(zhuan)膜液(ye)（貨號(hao)：RT5020） 恒流(liu)400 mA 30 min
封(feng)(feng)閉(bi)：無蛋白快(kuai)速封(feng)(feng)閉(bi)液（貨號：PF1070）常溫(wen)封(feng)(feng)閉(bi)10 min
膜去除抗(kang)體程(cheng)序(xu)：37度，搖床60rpm 10分(fen)鐘
圖(tu)1：一抗(kang)：PCNA鼠單(dan)抗(kang) 1:5000，RT 60min；二抗(kang)：羊抗(kang)鼠IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝(pu)光1秒(miao)
圖2：膜(mo)第1次(ci)清除后抗(kang)體(ti)(ti)去除效(xiao)果(guo)檢(jian)測：膜(mo)水漂洗(xi)3次(ci)，加入(ru)5 ml抗(kang)體(ti)(ti)去除液去除抗(kang)體(ti)(ti)，TBST漂洗(xi)3次(ci)，ECL曝光5分鐘，膜(mo)上(shang)幾(ji)乎(hu)無(wu)可見(jian)條(tiao)帶，說明二(er)抗(kang)去除干凈。
圖3：膜第1次清除后，H3檢測： H3鼠單抗 1:10000 RT 60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 RT 60min孵育，ECL曝(pu)光5秒。
圖4：膜第2次清除后，GAPDH檢測： GAPDH兔多抗 1:3000 RT 60 min孵育(yu)，羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光150秒。
圖5：膜第3次清除(chu)后，PCNA檢測：PCNA鼠單抗 1:5000 RT 60 min孵育(yu)(yu)，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 RT 60min孵育(yu)(yu)，ECL曝光1秒。