非變性蛋白電泳Marker轉膜問題
非變性蛋白電泳Marker轉膜問(wen)題
1. 所有的預染蛋白Marker都是變性Marker，不適用于非變性電泳。
2. 蛋(dan)白非變性電泳條(tiao)件下，不能精確(que)判斷蛋(dan)白的分子量大小。因為在(zai)非變性條(tiao)件下，蛋(dan)白的(de)電荷，空間結構(gou)，物化性質等都對(dui)蛋(dan)白的(de)遷移有影(ying)響。
3. 非變性蛋白(bai)電泳Marker（RTD6137，RTD6142，RTD6144）由于要保持蛋白的(de)天然結構，都沒有(you)偶聯染料(liao)，在(zai)電泳(yong)時基(ji)本都看(kan)不到(dao)條帶；然而，RTD6137和(he)RTD6144中的(de)440 kD和(he)880 kD由于天然蛋白中含(han)有(you)鐵離子，使得電泳(yong)后在(zai)膠(jiao)上可見淡黃色(se)(se)，其中440 kD顏(yan)色(se)(se)更深。凝膠(jiao)轉膜后，膜上也可以(yi)看(kan)到(dao)黃色(se)(se)的(de)440 kD條帶（下圖），可以(yi)大體判斷(duan)Marker轉膜的(de)效果。
4. 有(you)兩種方法可以解決非變性Marker轉膜后條帶(dai)顯示問題：
第一種方法：凝膠轉膜(mo)后用麗(li)春紅(hong)染色液（貨(huo)號：RTD6301）染(ran)(ran)膜，可(ke)以看到Marker條帶，順便可(ke)以檢測轉膜效率，然而要注意的是麗春(chun)紅染(ran)(ran)色靈(ling)敏(min)度(du)比較(jiao)低，可(ke)能(neng)不能(neng)完全(quan)看到完整的Marker條帶。
注：北京師范大學惠(hui)贈圖片
第二種方法（下圖）：電泳(yong)結束后，把含(han)有(you)Marker泳(yong)道的凝膠切(qie)下，單(dan)獨用考馬斯(si)亮藍(lan)染(ran)色液染(ran)色（貨號：RTD6202），剩余的(de)凝(ning)膠去完成轉膜到ECL發光(guang)檢測過程(cheng)，最后(hou)的(de)發光(guang)結果和(he)Marker染色結果拼接判斷條帶范圍。
Jurkat 無去垢劑提取TP，GAPDH檢測（pI~8.6）：
凝膠：RTD6139-0416 BN預制膠
電泳：1×藍色電泳緩沖液（含0.002% G-250）
穩壓150V 45分鐘；1×無色電泳緩沖液 穩壓150V 46分鐘
膠浸泡：1×BN轉膜緩沖液（含20%甲醇）+0.1%SDS浸泡10分鐘
轉膜：1×BN轉膜緩沖液（含20%甲醇），穩流200 mA
（電壓89-81V） 1.5小時，未冰浴
膜漂洗去藍色：PVDF膜無水甲醇浸泡10分鐘至膜無色
封閉：無蛋白快速封閉，RT，30分鐘
一抗：GAPDH抗體，1：5000 RT 一小時
二抗：羊抗兔IgG-HRP 1：5000 RT 1.5小時
ECL：ECL發光(guang)，機(ji)器(qi)拍照(zhao)，曝光(guang)2min