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Western一抗二抗去除液（弱堿(jian)，溫和型）

● 產品簡(jian)介(jie)：

Western一抗(kang)二抗(kang)去除液（弱堿，溫和型）(Western Antibody Stripping Buffer，weak alkaline，mild type)可(ke)(ke)以(yi)(yi)高效去除印(yin)跡(ji)膜(mo)(mo)上的(de)一抗(kang)和二抗(kang)，而吸附在(zai)膜(mo)(mo)上的(de)抗(kang)原基本(ben)不(bu)受(shou)影響，用于Western中轉移了蛋白膜(mo)(mo)的(de)重(zhong)復(fu)利用，可(ke)(ke)以(yi)(yi)轉一次(ci)(ci)膜(mo)(mo)，做多次(ci)(ci)Western印(yin)跡(ji)實驗，通常可(ke)(ke)以(yi)(yi)重(zhong)復(fu)利用膜(mo)(mo)5-8次(ci)(ci)（PVDF膜(mo)(mo)）。使(shi)用本(ben)試劑(ji)只需大約30分鐘即(ji)可(ke)(ke)實現(xian)蛋白膜(mo)(mo)的(de)重(zhong)復(fu)使(shi)用，然后(hou)可(ke)(ke)以(yi)(yi)進行(xing)Western的(de)后(hou)續(xu)操作。

該產品(pin)具有以(yi)下(xia)幾個優點：

1.可用(yong)于(yu)昂貴或(huo)珍稀樣本(ben)的(de)多(duo)次(ci)雜交；

2.有利于用不同(tong)抗(kang)體分析單(dan)次印跡上的不同(tong)蛋白，比如不同(tong)亞(ya)型的抗(kang)體；

3.有利于對異常(chang)結果進行重新分析(xi)或(huo)確(que)認；

4.有利于糾正(zheng)孵(fu)錯的(de)抗體；

5.節約試(shi)劑成本，并節約時間。

各種去除液的選擇請點擊Western一抗二抗去除液選擇指南。

● 貯存(cun)：

   常溫貯存，有效期一年(nian)；常溫運輸。

● 用(yong)前必(bi)讀：

1. 理想的(de)(de)抗(kang)(kang)體去(qu)除(chu)液(ye)應該是(shi)洗(xi)脫抗(kang)(kang)體的(de)(de)同時(shi)，不洗(xi)脫膜上結(jie)(jie)合的(de)(de)蛋白或(huo)者不改變抗(kang)(kang)原(yuan)的(de)(de)結(jie)(jie)合性質(zhi)，但是(shi)目前沒有(you)(you)(you)一(yi)種(zhong)去(qu)除(chu)液(ye)可以做到只洗(xi)脫抗(kang)(kang)體，而完全不洗(xi)脫膜上結(jie)(jie)合的(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)；也(ye)沒有(you)(you)(you)一(yi)種(zhong)去(qu)除(chu)液(ye)可以適(shi)用(yong)(yong)于所有(you)(you)(you)不同親和度的(de)(de)抗(kang)(kang)原(yuan)抗(kang)(kang)體復合物。去(qu)除(chu)液(ye)洗(xi)脫能(neng)力太(tai)強，抗(kang)(kang)原(yuan)也(ye)容易被(bei)洗(xi)脫；太(tai)弱，則抗(kang)(kang)體殘留太(tai)高。因此，從(cong)免疫印(yin)跡膜上去(qu)除(chu)抗(kang)(kang)體的(de)(de)方案僅能(neng)用(yong)(yong)于定性用(yong)(yong)途，因為(wei)在(zai)每個抗(kang)(kang)體清除(chu)循環(huan)中，或(huo)多或(huo)少(shao)都將洗(xi)去(qu)少(shao)量膜上的(de)(de)蛋白。

2. PVDF膜(mo)比硝酸(suan)纖維素膜(mo)（NC膜(mo)）更堅韌，因此(ci)優(you)先(xian)推薦使用(yong)PVDF膜(mo)用(yong)于涉及抗體(ti)剝離的實驗。

3. 從(cong)SDS-PAGE凝(ning)膠(jiao)轉印(yin)完(wan)成(cheng)后立(li)即干(gan)燥PVDF膜(mo)(mo)或NC膜(mo)(mo)，可改善(shan)蛋(dan)白質與膜(mo)(mo)的(de)結合，特別(bie)推薦用(yong)(yong)于涉及多次抗體剝離(li)的(de)實(shi)驗(yan)。在第一輪抗體檢測之前，必須使用(yong)(yong)甲醇將干(gan)燥的(de)PVDF膜(mo)(mo)潤濕或用(yong)(yong)1×TBST將干(gan)燥的(de)NC膜(mo)(mo)潤濕。已經結(jie)合有抗(kang)體的膜，決(jue)不(bu)能使得(de)膜干燥(zao)，否則抗(kang)體分(fen)子將與膜結(jie)合緊密，很難剝(bo)離。因(yin)此，在做完一輪ECL發(fa)光(guang)檢(jian)測實驗后(hou)，需要(yao)用(yong)清除(chu)液清除(chu)掉膜上的抗體，推薦將膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 檢測時，優先(xian)檢測低(di)豐度抗原：先(xian)孵(fu)育(yu)條帶較(jiao)弱（表達較(jiao)低(di)）的(de)蛋(dan)白(bai)，再(zai)孵(fu)育(yu)條帶明顯（表達較(jiao)高）的(de)蛋(dan)白(bai)，最后再(zai)孵(fu)育(yu)內參。

5. 如條件允(yun)許，下(xia)一(yi)輪的抗(kang)體雜(za)交(jiao)實驗選擇種(zhong)屬(shu)來源不同的一(yi)抗(kang)（對應不同種(zhong)屬(shu)的二(er)抗(kang)），減少檢(jian)測的交(jiao)叉(cha)反應。

6. 該清(qing)除液適用于ECL發光檢(jian)測(ce)的膜上抗體清(qing)除，不(bu)(bu)適合于膜上直(zhi)接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不(bu)(bu)適合熒光檢(jian)測(ce)。

● 使用說明：

1. 在完成Western化學(xue)發光檢測后，NC膜(mo)或PVDF膜(mo)用適量蒸餾水中震蕩漂洗5分鐘；重復漂洗2次。

2. 棄蒸餾水，加入適量(liang)的Western一(yi)抗二抗去(qu)除液，根據下(xia)表操作。孵(fu)育溫度和時間會明顯影響抗體去(qu)除效果(guo)，參(can)照下(xia)表調整。

3. 棄去(qu)除液，加入足量蒸餾水，在搖床上漂洗(xi)2次，每次5分鐘，把(ba)去(qu)除液徹底漂洗(xi)干凈。

  注(zhu)：殘余(yu)的去(qu)除液(ye)會影(ying)響后續抗(kang)原抗(kang)體(ti)的的結合。

4. 可(ke)選步驟：漂洗(xi)后的(de)轉印膜(mo)孵育ECL發(fa)(fa)光液，檢測二抗(kang)的(de)清除效率(lv)。曝(pu)光5-10分鐘，膜(mo)上看(kan)不到發(fa)(fa)光條帶表明二抗(kang)清除得比較干凈。如果膜(mo)上能看(kan)到條帶，重復步驟2-3。

5．繼續進行(xing)Western的(de)后續操(cao)作（封閉(bi)-抗體孵育-發光(guang)檢測）。

   注(zhu)：建議(yi)每次膜剝離后都要進行重新(xin)封(feng)閉(bi)，以(yi)降低背景。

● 實驗示(shi)例：

樣(yang)品：K562細胞,SDS裂解液（貨號：RL1060）提取(qu)總蛋白；

電泳：4-20% RealPAGE預制(zhi)膠（貨號：RTD6117-0420）電泳

轉膜：NC膜，1×RealBlot快速轉膜液(ye)（貨(huo)號：RT5020）快速濕(shi)轉，恒流400 mA 30 min

圖1：Western快速封(feng)(feng)閉(bi)液(ye)（貨號：WR5020）RT 快封(feng)(feng)  15 min；一抗：β-Actin鼠單抗 1:10000  RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min；ECL（貨號：EC2520）曝光1秒(miao)。

圖2： Western一抗二抗去除液（弱堿，溫(wen)和(he)型） RT 20分鐘剝離(li)，ECL曝光11分鐘，二抗去除干凈。

圖3： Western快速(su)封閉液（貨號：WR5020）RT 快封20分鐘；一抗(kang)(kang)：PCNA鼠(shu)單抗(kang)(kang)1：5000 RT 60min，二抗(kang)(kang)羊抗(kang)(kang)鼠(shu)IgG-HRP 1:5000，ECL（貨號：EC2520）曝光1秒。

圖4： 膜第二(er)次剝離(li)RT 30分鐘，ECL自動曝光11min ，二(er)抗去除(chu)干凈

圖5： Western快速封閉液（貨號：WR5020）RT 快封30min；一抗：GAPDH兔多抗 1:3000 60min，二(er)抗：羊抗兔IgG-HRP RT 60min，ECL曝光2分(fen)16秒。

Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型(xing)） PVDF膜測試

樣品：K562細(xi)胞,SDS裂(lie)解液(貨號：RL1060)提取總蛋白

電泳條件：12% RealPAGE預(yu)制(zhi)膠（貨(huo)號：RTD6117-0012）， 恒壓150 V 1×TGS  73 min

轉膜條件：PVDF膜 孔(kong)徑0.45μm，1×RealBlot快速轉膜液（貨號：RT5020） 恒流(liu)400 mA 30 min

封(feng)閉：無蛋白快速(su)封(feng)閉液(ye)（貨(huo)號：PF1070）常(chang)溫封(feng)閉10 min

膜去除抗體程序：37度(du)，搖床(chuang)60rpm 10分鐘(zhong)

圖1：一抗：PCNA鼠單(dan)抗 1:5000，RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光1秒

圖2：膜第1次清(qing)除后抗體去(qu)(qu)除效果(guo)檢(jian)測：膜水漂洗3次，加(jia)入5 ml抗體去(qu)(qu)除液(ye)去(qu)(qu)除抗體，TBST漂洗3次，ECL曝光5分鐘，膜上幾(ji)乎無可見(jian)條帶，說明二(er)抗去(qu)(qu)除干凈。

圖3：膜第(di)1次清(qing)除后，H3檢測： H3鼠(shu)單(dan)抗 1:10000  RT  60 min孵育，羊抗鼠(shu)IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光5秒。

圖4：膜第(di)2次(ci)清除后，GAPDH檢測： GAPDH兔(tu)多(duo)抗 1:3000  RT 60 min孵育，羊抗兔(tu)IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝(pu)光150秒。

圖5：膜第3次(ci)清除后，PCNA檢測：PCNA鼠單(dan)抗 1:5000  RT  60 min孵(fu)育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵(fu)育，ECL曝光1秒。