Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit Ver.731072
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貨(huo)號(hao)
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名稱
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包裝
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RTD6140
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Blue/Clear 非變性(xing)凝膠電泳試劑盒(手灌(guan)膠(jiao))
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10 次
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● 貨品內容：
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組(zu)份
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貨號
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名稱
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規格
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保存(cun)
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1
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RTD6140-01
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2×BN/CN凝(ning)膠緩沖液
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40 ml
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4℃
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2
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AC2914-30ml
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40%
PAA（29:1）
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30 ml
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4℃
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2
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BC500P
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10×BN/CN PAGE電泳緩(huan)沖液(干粉)
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500 ml
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RT
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3
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PL114-01
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩(huan)沖液
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1 ml
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-20℃
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4
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BC270
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2% G-250染料（電泳用）
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20 ml
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RT
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5
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BC260-01
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5% G-250染料(liao)（上樣用）
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1 ml
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4℃
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6
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SR0510
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濃(nong)縮(suo)膠(jiao)紅色添加染(ran)料(200×)
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0.5 ml
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RT
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7
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AP020P
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APS（干粉）
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0.5 g
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RT(配制后-20℃貯存)
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8
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃ 避光
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9
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說明書
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一(yi)份
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● 產品簡介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從生物樣品（質膜，胞漿等）中分離分子量10 kD-10 M kD 范圍的蛋白質復合物的電泳技術。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)復(fu)合(he)(he)體從細胞(bao)膜中以近似天然的(de)狀(zhuang)態分(fen)(fen)(fen)離出(chu)來，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬(ma)斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)結合(he)(he)而使其(qi)(qi)帶負(fu)電荷(he)，根據蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)分(fen)(fen)(fen)子量不同在 PAGE膠中得到(dao)分(fen)(fen)(fen)離；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電泳(yong)緩沖液中不加入任何(he)染(ran)料，電泳(yong)中始終保(bao)持蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)天然電荷(he)和活性狀(zhuang)態，然而，其(qi)(qi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)分(fen)(fen)(fen)辨率要低于Blue Native PAGE。另外(wai)，BN-PAGE由于考馬(ma)斯亮藍G-250存在，使蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)都覆蓋(gai)上負(fu)電荷(he)，可以分(fen)(fen)(fen)離堿性蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)（pI＞7）和酸(suan)性蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(pI＜7)；而CN-PAGE只適合(he)(he)于酸(suan)性蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)（pI＜7）的(de)分(fen)(fen)(fen)離。
本產品(pin)包括(kuo)BN/CN-PAGE制(zhi)膠的所有成分(fen)，方(fang)便(bian)使用(yong)。可(ke)(ke)以用(yong)于(yu)(yu)分(fen)離分(fen)子量在 10 kD-500 kD 的蛋白(bai)(bai)復合體(ti)，樣品(pin)可(ke)(ke)以來于(yu)(yu)胞漿、細(xi)胞總裂解液、細(xi)胞膜(mo)(mo)、線粒體(ti)膜(mo)(mo)和(he)葉(xie)綠體(ti)膜(mo)(mo)等。電泳后可(ke)(ke)直接用(yong)于(yu)(yu)考染、銀染、Western 雜(za)交、SDS-PAGE電泳、蛋白(bai)(bai)純化(hua)、蛋白(bai)(bai)活性檢測等分(fen)析實驗，也可(ke)(ke)直接用(yong)于(yu)(yu)電洗(xi)脫制(zhi)備蛋白(bai)(bai)。
試劑盒配(pei)套有紅色(se)(se)濃縮膠添(tian)加(jia)染(ran)料,凝固后的濃縮膠為(wei)紅色(se)(se),有利于在藍色(se)(se)電泳緩沖液中觀察(cha)加(jia)樣孔,方(fang)便上樣。
本試(shi)劑盒(he)大約可(ke)以配(pei)制(zhi)8-25塊常規大小（8×10 cm）PAGE凝膠(jiao)，具體數量根(gen)據凝膠(jiao)濃度和(he)厚度決(jue)定，1 mm厚度8%凝膠(jiao)可(ke)以配(pei)制(zhi)至(zhi)少10塊膠(jiao)。
● 運輸和貯存：
本產品常溫運輸；組份按照標簽(qian)溫度貯存；有效期一年。
● 使用說明：
一. 樣品制備：
該試劑盒不含樣品制備的相關試劑，根據樣品種類，具體選擇不同提取方法。植物類囊體BN樣品制備可以選擇植物類囊體膜提取試劑盒（貨號：RTU5002）；動物總蛋白BN樣品制備可以選擇動物胞漿活性蛋白提取試劑盒（不含去垢劑，離心柱法）（貨號：RTD8106）；動物膜蛋白BN樣品制備可以選擇動物膜蛋白提取試劑盒(細胞)（貨號：RTD8111）和動物(wu)膜蛋白提取試劑(ji)盒(he)(he)(組織(zhi)(zhi))（貨號：RTD8112）；動物(wu)線(xian)粒體BN樣品(pin)制備(bei)可以選擇(ze)動物(wu)細胞線(xian)粒體提取試劑(ji)盒(he)(he)（貨號：RTD8115）和動物(wu)組織(zhi)(zhi)線(xian)粒體提取試劑(ji)盒(he)(he)（貨號：RTD8117）。
二. 制膠：
2.1 分離膠制備：
2.1.1 不(bu)同(tong)濃(nong)度的(de)分離膠的(de)最佳分離范圍：
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分離膠(jiao)濃度
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最(zui)佳(jia)分離范圍
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6%
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80-500 kD
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8%
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50-350 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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2.1.2根據表一，將不同(tong)體積的成分在小燒杯中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免(mian)產生氣(qi)泡(pao)
2.1.3在凝(ning)膠(jiao)模(mo)具中灌入適量(liang)分離膠(jiao)溶液(ye)(ye)（對于mini-gel，凝(ning)膠(jiao)液(ye)(ye)加至約(yue)距前玻璃板(ban)頂端1.5 cm或距梳齒約(yue)0.5 cm即可(ke)），然后在分離膠(jiao)溶液(ye)(ye)上輕輕覆蓋(gai)一層(ceng)1-3 cm的水層(ceng)，使凝(ning)膠(jiao)表面保持平(ping)整。
2.1.4靜置15-30分(fen)鐘，待分(fen)離膠(jiao)和水(shui)層之間出現一個清(qing)晰的界面后，說明凝膠(jiao)已聚合(he)。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
表一 Blue/Clear Native PAGE分離膠配方表
（以一塊1.0 mm厚度mini膠為例）
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分離膠總(zong)體積 5 ml
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6%
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8%
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10%
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12%
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15%
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組份(fen)
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組(zu)份(fen)加入(ru)體積（ml）
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滅菌水
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1.7
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1.45
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1.2
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0.95
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0.57
|
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2×BN/CN凝膠緩(huan)沖液(ye)
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2.5
|
2.5
|
2.5
|
2.5
|
2.5
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40％ PAA（29:1）
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0.75
|
1
|
1.25
|
1.5
|
1.875
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10％ APS
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0.05
|
0.05
|
0.05
|
0.05
|
0.05
|
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TEMED
|
0.005
|
0.005
|
0.005
|
0.005
|
0.005
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2.2 濃縮膠制備：
2.2.1去除覆蓋在分離(li)膠上(shang)的(de)水(shui)層。
2.2.2按照表二將不同成分(fen)在一個小燒杯中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免產生(sheng)氣泡。
2.2.3將濃(nong)縮膠(jiao)溶液加至分離膠(jiao)的(de)(de)上面，直至凝膠(jiao)溶液到達前(qian)玻璃(li)板的(de)(de)頂端。
2.2.4將梳子插入凝(ning)膠內，避免產生氣(qi)泡(pao)。
2.2.5靜(jing)置30-60分鐘，等(deng)待濃縮膠聚合。
注：凝膠的(de)聚(ju)合時(shi)間(jian)與(yu)環境溫(wen)度有關。夏天(tian)溫(wen)度較(jiao)高時(shi)，聚(ju)合較(jiao)快；冬天(tian)氣溫(wen)低時(shi)，聚(ju)合時(shi)間(jian)會延長(chang)。可以(yi)根據環境溫(wen)度的(de)不同調節APS的(de)加入量(liang)。
表二 Blue/Clear Native PAGE濃縮膠（4%）配方表（以一塊1.0mm厚度mini膠為例）
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組份(fen)
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不(bu)同凝膠體積對(dui)應各組份的(de)取樣量
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濃縮膠總體積2 ml
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H2O
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0.8 ml
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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1 ml
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40％ PAA（29:1）
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0.2 ml
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濃縮膠紅色(se)添加(jia)染料(200×)
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10 μl
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10％ APS
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20 μl
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|
TEMED
|
2 μl
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三. 電泳：
3.1 準備電泳緩沖液：
將10×BN/CN PAGE電泳緩沖液(ye)(ye)（干粉）溶(rong)于500 ml滅菌水(shui)中，徹(che)底溶(rong)解，測定pH應為7.0左(zuo)右，不要(yao)調節pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(ye)(ye)。
3.1.1 CN-PAGE電(dian)泳：
陽(yang)極(ji)緩沖液(ye)和陰(yin)極(ji)緩沖液(ye)均直(zhi)接使(shi)用1×BN/CN PAGE電(dian)泳緩沖液(ye)進行電(dian)泳。
3.1.2 BN-PAGE電泳(yong)：
陽極緩沖液(ye)(外(wai)槽)使(shi)用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(ye)，陰極緩沖液(ye)(內(nei)槽)按照下表配制：
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1×藍色陰極(ji)緩沖(chong)液(ye)
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150 ml
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10×BN/CN PAGE電泳(yong)緩(huan)沖液(ye)
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15
ml
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2% G-250 染料（電泳用(yong)）
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1.5 ml
|
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超(chao)純水(shui)
|
定容(rong)至150
ml
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3.2 準備樣品：
3.2.1 CN-PAGE電泳：
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總體(ti)積
|
10
μl
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蛋白樣品
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上(shang)樣緩沖液
|
2.5 μl
|
|
超純水
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補(bu)至10 μl
|
|
|
不要(yao)加熱
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3.2.2 BN-PAGE電泳：
3.2.2.1
植物類囊體膜蛋白電(dian)泳：
|
總體積
|
10
μl
|
|
|
含去垢劑樣品*
|
|
植物類囊體膜蛋白樣(yang)品(pin)
（2%DDM增溶）
|
x μl
|
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖(chong)液
|
2.5 μl
|
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5%
G-250染料(liao)（蛋白上(shang)樣(yang)）
|
1 μl
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超純水(shui)
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補至10 μl
|
|
|
不要加(jia)熱
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*植物(wu)類囊體膜蛋(dan)白電(dian)泳中，含(han)去垢劑樣品(pin)中染料加入按照以下原則：
植物類囊體樣品中G250終(zhong)濃(nong)(nong)度(du)為去垢劑終(zhong)濃(nong)(nong)度(du)的1/4。例(li)如樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖(tang)苷）終(zhong)濃(nong)(nong)度(du)為2%，則需要G-250終(zhong)濃(nong)(nong)度(du)為0.5%。10 μl蛋白樣品中需要加5%
G-250染(ran)料1 μl。
3.2.2.2
動物線(xian)粒體BN樣(yang)品電泳(yong)：
|
總體積
|
10
μl
|
|
|
含去(qu)垢劑(ji)樣品*
|
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動物線粒體BN樣品
（1%DDM增(zeng)溶）
|
x μl
|
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4×BN/CN-PAGE蛋白上(shang)樣緩沖液
|
2.5 μl
|
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5%
G-250染(ran)料（蛋(dan)白上(shang)樣）
|
0.25 μl
|
|
超純(chun)水
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補至10 μl
|
|
|
不要(yao)加熱
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*動物線粒(li)體BN樣(yang)品(pin)電泳中，含(han)去垢劑(ji)樣(yang)品(pin)中染料加(jia)入按照以下(xia)原則：
動物線粒體BN樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/8。例如樣品中DDM終濃度為1%，則需要G-250終濃度為0.125%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
3.2.2.3
不含去垢劑樣品：
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總(zong)體積
|
10
μl
|
|
不含去垢劑樣品
|
x μl
|
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4×BN/CN-PAGE蛋(dan)白上(shang)樣緩(huan)沖(chong)液
|
2.5 μl
|
|
5%
G-250染料（蛋(dan)白上樣）
|
- #
|
|
超純水
|
補至10 μl
|
|
|
不要加熱
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# 不含去垢劑樣品可以不必添加5%G-250染料。
3.3電泳過程；
3.3.1 CN-PAGE電泳：
電(dian)泳內外槽均使用1×BN/CN PAGE電(dian)泳緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)。在(zai)電(dian)泳槽的(de)內槽內加入(ru)(ru)1×BN/CN PAGE電(dian)泳緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(讓(rang)電(dian)泳緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)漫過加樣(yang)孔(kong))，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)撥出預制膠(jiao)梳(shu)子，用1ml吸頭沖(chong)(chong)洗(xi)加樣(yang)孔(kong)3次，隨后在(zai)電(dian)泳槽外槽加入(ru)(ru)適量的(de)1×BN/CN PAGE電(dian)泳緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)。
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CN-PAGE電泳
|
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恒(heng)電壓
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起始電(dian)流
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結(jie)束電流
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電泳(yong)時間(jian)
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120V
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10-15mA/板膠
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4-10mA/板膠
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50+min
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注：冰(bing)浴電泳
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3.3.2 BN-PAGE電泳：
BN-PAGE電泳外槽使用1×BN/CN電泳緩沖液；內槽開始電泳使用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電(dian)泳(yong)(yong)，等待電(dian)泳(yong)(yong)指示前沿到達距離(li)凝膠頂部2/3處(chu)時(shi)，將電(dian)泳(yong)(yong)緩(huan)沖(chong)液更換為1×BN/CN電(dian)泳(yong)(yong)緩(huan)沖(chong)液，繼續(xu)(xu)后續(xu)(xu)電(dian)泳(yong)(yong)，因為過多染料(liao)會(hui)影響蛋白(bai)在凝膠中的遷移以(yi)及蛋白(bai)后續(xu)(xu)的轉(zhuan)膜實驗。
BN-PAGE電泳條件（一板膠）
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恒(heng)電壓
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起始(shi)電流(liu)
|
電泳時間(jian)
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緩沖(chong)液
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|
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120 V
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8-15 mA
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20-25
min
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1×藍色陰(yin)極緩沖液
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冰浴電泳
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指示前沿至凝膠頂部三分之二處，更換內槽緩沖液為無色1×BN/CN
電泳緩沖液
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恒電壓
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繼續電泳時間(jian)
|
結束電流
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緩沖(chong)液(ye)
|
|
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120 V
|
45 min
+
|
3-5 mA
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1×BN/CN電(dian)泳緩沖(chong)液
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冰浴電(dian)泳
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四. 轉膜：
BN-PAGE轉膜(mo)必(bi)須用(yong)PVDF膜(mo)，不能用(yong)NC膜(mo)，因為NC膜(mo)與G-250結合非常緊密(mi)。
轉膜緩沖液(ye)可(ke)以(yi)使用(yong)10×BN轉膜緩沖液(ye)（貨(huo)號：BC600P）。
五. 染色：
5.1 將電(dian)泳后的PAGE膠取下(xia)放入(ru)塑料容器中，加入(ru)適量FastBlue蛋(dan)白染色液（以(yi)剛剛覆蓋過膠面(mian)為(wei)適），條帶1-2分(fen)鐘即可(ke)見。
5.2 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶(dai)清晰(xi)可見。
5.3 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常(chang)溫搖動(dong)10-15分鐘至背景(jing)干凈(jing)。
5.4 觀(guan)察保存(cun)結果。
六. 實驗示例：
RTD6140 Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠） WB檢測
樣品處理：K562懸浮細胞提取胞漿活性蛋白（貨號：RTD6106 動物活性蛋白提取試劑盒（不含去垢劑））
4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號：PL114） 調整蛋白濃度為1μg/μl上樣液，梯度上樣5-20μg
電泳：8% BN手灌膠，穩壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上沿2/3處，
更換為無色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，電泳時間共83分鐘
轉膜：0.45 μm PVDF膜，10×BN轉膜緩沖液（貨號：BC600P）稀釋為1×BN轉膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA 2小時，未冰浴。
轉膜效果檢測：膜用麗春紅染色液染色（貨號：RTD6301）有可見條帶，膠用FastBlue蛋白染色液染色
（貨號：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉膜成功。膜用無水甲醇清洗5分鐘去除膜上藍色殘余。
封閉：Western快速封閉液（貨號：WR5020） RT 封閉10 分鐘；
一抗：兔單抗GAPDH 1:10000 RT 60min；二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，
ECL檢測：RealECL發光液（貨號：EC2520），曝光1秒。
使用RTD6140
Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）產品發表部分文章列表：
1.
[2022 IF=2.9] Identification and structural analysis of
dimeric chicken complement
component 3d and its binding with
chicken complement receptor 2.
Author: Huan Jin, Min Tu, Zhaoying Meng, Bo Jiang,
Qianqian Yang, Yongqing Li,Zhenhua Zhang
Journal: Developmental and Comparative Immunology 152
(2024) 105109
Institution: Institute
of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and
Forestry Sciences
Paper link：