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RealPAGE plus彩色(se)凝膠快速制備試劑盒

 RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit

●  貨品規格：

●  貨品內容：

● 產品(pin)簡介：

該產品利用聚丙烯酰胺凝膠電(dian)泳(yong)(yong)原理(li)，采用合(he)理(li)設(she)計的預(yu)混合(he)配(pei)(pei)方和(he)配(pei)(pei)制(zhi)流程，可(ke)在50分鐘內配(pei)(pei)制(zhi)得(de)到高質量(liang)的聚丙烯酰胺凝膠，用于變性和(he)非(fei)變性蛋白凝膠電(dian)泳(yong)(yong)。本產品可(ke)以(yi)配(pei)(pei)制(zhi)常用分離膠濃(nong)度6%、8%、10%、12%和(he)15%，可(ke)以(yi)滿足絕大多(duo)數蛋白電(dian)泳(yong)(yong)需求。

本試劑盒大(da)約可以(yi)配(pei)制60-125塊(kuai)(kuai)常(chang)規大(da)小（8×10cm）PAGE凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)，具體(ti)數量根據凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)厚(hou)度決定(ding)：0.75mm厚(hou)度凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)可以(yi)配(pei)制125塊(kuai)(kuai)膠(jiao)，1mm厚(hou)度凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)可以(yi)配(pei)制至(zhi)少90塊(kuai)(kuai)膠(jiao)，1.5mm厚(hou)度凝(ning)(ning)(ning)膠(jiao)可以(yi)配(pei)制至(zhi)少60塊(kuai)(kuai)膠(jiao)。

● 運(yun)輸和貯存(cun)：

本產品(pin)常溫運輸；組份按照標簽溫(wen)度貯存；有效期一(yi)年。

● 特點：

1. 方便(bian)：彩色上(shang)層(ceng)(ceng)膠，方便(bian)上(shang)樣；上(shang)層(ceng)(ceng)膠和(he)下層(ceng)(ceng)膠溶(rong)液1:1混合(he)，無需計算；

2. 安全：不用接觸有毒粉末(mo)；不用單(dan)獨添加TEMED；

● 使用(yong)說明：

一(yi)  凝膠制備：

1.1參照凝膠模具說(shuo)明(ming)書(shu)，裝(zhuang)配好凝膠模具。

1.2 根據(ju)下表參(can)考選擇合(he)適的凝膠濃度

表一(yi)不同濃度的PAGE下(xia)層膠的最佳分(fen)離范圍

1.3 根據下表(biao)配制凝膠：

表二 凝膠配制表

1.3.1 取等體積(ji)下層(ceng)膠溶液B 和下層(ceng)膠溶液A ，各(ge) 2.0/2.5/4.0 ml，混勻；

1.3.2混合溶(rong)液中(zhong)加入(ru) 40/50/80 μl的(de)改良型促凝劑，輕輕混勻(yun)，將(jiang)混勻(yun)后的(de)溶(rong)液注入(ru)制(zhi)膠玻(bo)璃(li)板中(zhong)，使液面和短玻(bo)璃(li)板上沿之(zhi)間的(de)距離比梳齒長0.5 cm即可；

注(zhu)意：此(ci)溶液為(wei)過量(liang)，請勿(wu)全部注(zhu)入(ru)。

1.3.3 沿玻璃板緩慢加入(ru)適(shi)量(liang)滅菌水(shui)(shui)或(huo)無水(shui)(shui)乙醇覆蓋于(yu)下層膠(jiao)之上，待(dai)下層膠(jiao)凝(ning)固后，倒去上層水(shui)(shui)或(huo)乙醇；

注(zhu)意：當(dang)水（乙(yi)醇）和膠(jiao)之間有一條折射線(xian)時，說明膠(jiao)已凝(ning)固(gu)；25℃時5-10分鐘(zhong)可(ke)以聚合。

1.3.4 取等體積彩色上(shang)層(ceng)膠溶液(ye)B和上(shang)層(ceng)膠溶液(ye)A ，各(ge) 0.5/0.75/1.0 ml，混(hun)勻；

1.3.5向混合(he)溶液中(zhong)加入 10/15/20 μl 的改(gai)良(liang)型促(cu)凝劑，輕輕混勻(yun)，插入梳齒(chi)；

1.3.6 待上層膠凝固(gu)后 （約20-40 min），拔去(qu)梳齒(chi)即可(ke)用于電(dian)泳。

注：凝(ning)膠的(de)聚(ju)合時(shi)間與(yu)環境溫(wen)度有(you)關。夏天(tian)溫(wen)度較(jiao)高時(shi)，聚(ju)合較(jiao)快；冬天(tian)氣溫(wen)低(di)時(shi)，聚(ju)合時(shi)間會(hui)延長(chang)。

上層膠25℃ 20-25分(fen)鐘可以(yi)聚合；18℃ 35-40分(fen)鐘可以(yi)聚合。

二  電泳：

2.1 SDS-PAGE變性電泳：

2.1.1電泳緩(huan)沖液配(pei)制：

將5×Tris-甘氨(an)(an)酸(suan)-SDS電泳(yong)緩(huan)(huan)沖液(ye)(ye)干粉（自備，組份0.96 M 甘氨(an)(an)酸(suan)，0.125 M Tris，0.5% SDS）全(quan)部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解(jie)，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨(an)(an)酸(suan)電泳(yong)緩(huan)(huan)沖液(ye)(ye)（此(ci)溶液(ye)(ye)不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨(an)(an)酸(suan)-SDS電泳(yong)緩(huan)(huan)沖液(ye)(ye)。

2.1.2 樣品處理(li)：融化-混合-變性-上(shang)樣

5×MonoColor蛋(dan)白(bai)上樣(yang)緩沖(chong)(chong)液常溫數分(fen)(fen)鐘(zhong)解凍后輕輕搖勻(yun)，以確保(bao)溶液混合均勻(yun)；將緩沖(chong)(chong)液與(yu)蛋(dan)白(bai)樣(yang)品按(an)照1：4的(de)比例混勻(yun)，如8 μl樣(yang)品加(jia)入2 μl 5×上樣(yang)緩沖(chong)(chong)液；將蛋(dan)白(bai)樣(yang)品置于95℃中加(jia)熱(re)5-10分(fen)(fen)鐘(zhong)；蛋(dan)白(bai)樣(yang)品加(jia)入凝膠(jiao)加(jia)樣(yang)孔內電泳(yong)。

2.1.3 電泳過程；

在電(dian)泳槽的內(nei)槽內(nei)加(jia)入1×Tris-甘氨(an)酸-SDS電(dian)泳緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(讓(rang)電(dian)泳緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液漫過加(jia)樣(yang)孔(kong))，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)的撥(bo)出梳子(zi)，用1ml吸頭徹底沖(chong)(chong)洗加(jia)樣(yang)孔(kong)，隨后在電(dian)泳槽外槽加(jia)入適量(liang)的1×Tris-甘氨(an)酸-SDS電(dian)泳緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液。

表三(san) SDS-PAGE電(dian)泳條(tiao)件

2.2 非變性電泳（Native PAGE）：

2.2.1電泳(yong)緩沖(chong)液配制(zhi)：

將5×Tris-甘氨(an)酸電泳緩(huan)沖(chong)液(ye)干粉(fen)（自備，組份(fen)0.96 M 甘氨(an)酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shui)徹底溶(rong)解，用(yong)水(shui)定容至1 L，即(ji)配成5×Tris-甘氨(an)酸電泳緩(huan)沖(chong)液(ye)（此(ci)溶(rong)液(ye)不(bu)用(yong)調節pH值）。用(yong)前再稀釋5倍即(ji)配成1×Tris-甘氨(an)酸-SDS電泳緩(huan)沖(chong)液(ye)。

2.2.2 樣品處(chu)理：融化(hua)-混合(he)-上樣

5×非(fei)(fei)變性(xing)非(fei)(fei)還原蛋(dan)白上樣(yang)緩沖(chong)液(ye)(ye)常溫數分鐘(zhong)解凍后輕(qing)輕(qing)搖勻(yun)，以確(que)保溶液(ye)(ye)混(hun)合均勻(yun)；將緩沖(chong)液(ye)(ye)與蛋(dan)白樣(yang)品(pin)(pin)按照(zhao)1：4的比(bi)例混(hun)勻(yun)，如(ru)8 μl樣(yang)品(pin)(pin)加(jia)入2 μl 5×上樣(yang)緩沖(chong)液(ye)(ye)；蛋(dan)白樣(yang)品(pin)(pin)加(jia)入凝膠加(jia)樣(yang)孔內電泳。注(zhu)：非(fei)(fei)變性(xing)電泳樣(yang)品(pin)(pin)不(bu)能加(jia)熱處理。

2.2.3 電泳過(guo)程；

在電泳(yong)(yong)槽的(de)內槽內加(jia)入(ru)(ru)1×Tris-甘(gan)氨酸電泳(yong)(yong)緩沖液(ye)(讓電泳(yong)(yong)緩沖液(ye)漫(man)過加(jia)樣孔(kong))，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)的(de)撥出梳子(zi)，用1ml吸(xi)頭徹底沖洗加(jia)樣孔(kong)，隨后在電泳(yong)(yong)槽外槽加(jia)入(ru)(ru)適量的(de)1×Tris-甘(gan)氨酸電泳(yong)(yong)緩沖液(ye)。

表四(si) Native PAGE電泳條(tiao)件(jian)

三. 染色：

1. 將電泳后的PAGE膠取下放入(ru)塑料容器中(zhong)，加入(ru)適量FastBlue蛋白(bai)染(ran)色液或常規(gui)考馬斯亮藍染(ran)色液（以(yi)剛(gang)剛(gang)覆蓋過膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。

2. 搖床常(chang)溫搖動10-15分鐘(zhong)至條帶清(qing)晰可見(jian)。

3. 加入適(shi)量蒸餾水脫(tuo)色，期間(jian)更換1-2次(ci)蒸餾水，搖(yao)床常溫搖(yao)動10-15分鐘(zhong)至背景干凈(jing)。

四. 實驗示例：