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RealPAGE plus彩色(se)凝膠(jiao)快(kuai)速(su)制備試劑盒

 RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit

●  貨品(pin)規格：

●  貨品內(nei)容(rong)：

● 產品簡介：

該(gai)產(chan)(chan)品利用(yong)聚丙(bing)烯酰胺凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)原理，采(cai)用(yong)合理設計的預混合配(pei)方和(he)配(pei)制(zhi)流程，可在50分鐘(zhong)內配(pei)制(zhi)得到高質量的聚丙(bing)烯酰胺凝(ning)膠(jiao)，用(yong)于變性(xing)和(he)非變性(xing)蛋(dan)白凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)。本產(chan)(chan)品可以配(pei)制(zhi)常用(yong)分離膠(jiao)濃(nong)度6%、8%、10%、12%和(he)15%，可以滿足絕大多數蛋(dan)白電(dian)泳(yong)需求。

本(ben)試劑盒大約(yue)可(ke)以(yi)配(pei)制(zhi)60-125塊(kuai)常規大小（8×10cm）PAGE凝膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)，具(ju)體數量(liang)根據凝膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)厚(hou)度決(jue)定：0.75mm厚(hou)度凝膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)可(ke)以(yi)配(pei)制(zhi)125塊(kuai)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)，1mm厚(hou)度凝膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)可(ke)以(yi)配(pei)制(zhi)至少(shao)90塊(kuai)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)，1.5mm厚(hou)度凝膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)可(ke)以(yi)配(pei)制(zhi)至少(shao)60塊(kuai)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)。

● 運輸和(he)貯存(cun)：

本(ben)產品(pin)常(chang)溫運輸；組份按照標(biao)簽溫度貯存；有效期一年。

● 特點(dian)：

1. 方(fang)(fang)便：彩色上(shang)層(ceng)膠，方(fang)(fang)便上(shang)樣；上(shang)層(ceng)膠和下層(ceng)膠溶液1:1混合(he)，無需計算；

2. 安全：不用接觸有毒(du)粉(fen)末；不用單(dan)獨(du)添加TEMED；

● 使(shi)用說(shuo)明：

一  凝膠(jiao)制備：

1.1參照凝膠模具說明書，裝配(pei)好(hao)凝膠模具。

1.2 根據下表參考(kao)選(xuan)擇合適的(de)凝膠(jiao)濃度

表一不同濃度的(de)(de)PAGE下層膠的(de)(de)最佳分離范圍(wei)

1.3 根據下表配制(zhi)凝膠：

表二 凝膠配制表

1.3.1 取等體積(ji)下層膠(jiao)(jiao)溶(rong)液B 和下層膠(jiao)(jiao)溶(rong)液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混勻；

1.3.2混(hun)合溶液(ye)中(zhong)加入 40/50/80 μl的改良型促凝(ning)劑，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻(yun)，將(jiang)混(hun)勻(yun)后的溶液(ye)注入制膠(jiao)玻璃(li)板中(zhong)，使液(ye)面和短玻璃(li)板上沿之間的距離比梳齒長0.5 cm即(ji)可；

注意：此溶液為過量(liang)，請(qing)勿(wu)全部(bu)注入(ru)。

1.3.3 沿玻璃板緩慢加(jia)入適量(liang)滅菌水或無水乙醇覆蓋于下(xia)層(ceng)膠(jiao)之上，待(dai)下(xia)層(ceng)膠(jiao)凝固后，倒去上層(ceng)水或乙醇；

注意：當水（乙(yi)醇(chun)）和(he)膠之間有一條(tiao)折(zhe)射(she)線時，說明膠已凝固；25℃時5-10分鐘可以聚合。

1.3.4 取(qu)等體積彩色上層(ceng)膠(jiao)溶液(ye)B和上層(ceng)膠(jiao)溶液(ye)A ，各(ge) 0.5/0.75/1.0 ml，混勻(yun)；

1.3.5向混合溶液中(zhong)加入(ru) 10/15/20 μl 的改良型促(cu)凝劑，輕(qing)輕(qing)混勻，插入(ru)梳齒；

1.3.6 待上層膠凝固后 （約20-40 min），拔去(qu)梳齒即可用(yong)于電泳。

注：凝膠的聚(ju)合(he)時(shi)(shi)間(jian)與環(huan)境溫度有關。夏天溫度較高(gao)時(shi)(shi)，聚(ju)合(he)較快(kuai)；冬天氣(qi)溫低時(shi)(shi)，聚(ju)合(he)時(shi)(shi)間(jian)會延長。

上(shang)層膠25℃ 20-25分鐘(zhong)可以(yi)聚合；18℃ 35-40分鐘(zhong)可以(yi)聚合。

二  電泳(yong)：

2.1 SDS-PAGE變性電泳：

2.1.1電泳緩沖液配制：

將(jiang)5×Tris-甘氨酸(suan)(suan)-SDS電(dian)泳緩沖液干粉（自備，組(zu)份0.96 M 甘氨酸(suan)(suan)，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加(jia)入約900 ml水(shui)(shui)徹底溶解，用水(shui)(shui)定(ding)容至(zhi)1 L，即配成(cheng)5×Tris-甘氨酸(suan)(suan)電(dian)泳緩沖液（此溶液不用調節(jie)pH值）。用前再稀釋5倍即配成(cheng)1×Tris-甘氨酸(suan)(suan)-SDS電(dian)泳緩沖液。

2.1.2 樣(yang)品處理：融化(hua)-混合-變性-上樣

5×MonoColor蛋(dan)(dan)白(bai)上樣(yang)緩沖液常溫數分鐘解凍(dong)后輕輕搖勻，以(yi)確保溶液混合(he)均勻；將(jiang)緩沖液與蛋(dan)(dan)白(bai)樣(yang)品按照1：4的比例混勻，如(ru)8 μl樣(yang)品加(jia)(jia)入2 μl 5×上樣(yang)緩沖液；將(jiang)蛋(dan)(dan)白(bai)樣(yang)品置(zhi)于95℃中加(jia)(jia)熱5-10分鐘；蛋(dan)(dan)白(bai)樣(yang)品加(jia)(jia)入凝膠加(jia)(jia)樣(yang)孔內(nei)電(dian)泳。

2.1.3 電泳過程；

在(zai)電泳(yong)槽的(de)(de)內(nei)槽內(nei)加入1×Tris-甘(gan)氨酸-SDS電泳(yong)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ye)(讓電泳(yong)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ye)漫過加樣(yang)(yang)孔)，輕(qing)輕(qing)的(de)(de)撥出(chu)梳子，用1ml吸頭徹(che)底沖(chong)(chong)洗加樣(yang)(yang)孔，隨后在(zai)電泳(yong)槽外槽加入適量的(de)(de)1×Tris-甘(gan)氨酸-SDS電泳(yong)緩(huan)(huan)沖(chong)(chong)液(ye)(ye)。

表三 SDS-PAGE電(dian)泳(yong)條件

2.2 非變(bian)性電泳（Native PAGE）：

2.2.1電(dian)泳緩沖液配制：

將5×Tris-甘氨(an)(an)酸電泳緩(huan)(huan)沖液(ye)(ye)干粉（自備，組份0.96 M 甘氨(an)(an)酸，0.125 M Tris）全(quan)部(bu)倒入(ru)1L燒杯中，加入(ru)約900 ml水徹底(di)溶解，用(yong)水定容至1 L，即配成(cheng)5×Tris-甘氨(an)(an)酸電泳緩(huan)(huan)沖液(ye)(ye)（此溶液(ye)(ye)不用(yong)調節pH值）。用(yong)前(qian)再稀釋5倍即配成(cheng)1×Tris-甘氨(an)(an)酸-SDS電泳緩(huan)(huan)沖液(ye)(ye)。

2.2.2 樣品處(chu)理：融化-混(hun)合(he)-上樣

5×非變(bian)性非還原蛋(dan)白(bai)上(shang)樣緩(huan)沖液(ye)(ye)常溫數分鐘解凍(dong)后輕輕搖(yao)勻(yun)(yun)，以(yi)確保溶液(ye)(ye)混(hun)合均(jun)勻(yun)(yun)；將緩(huan)沖液(ye)(ye)與蛋(dan)白(bai)樣品按照1：4的(de)比例混(hun)勻(yun)(yun)，如(ru)8 μl樣品加(jia)入2 μl 5×上(shang)樣緩(huan)沖液(ye)(ye)；蛋(dan)白(bai)樣品加(jia)入凝膠加(jia)樣孔(kong)內電泳。注：非變(bian)性電泳樣品不能加(jia)熱處理。

2.2.3 電(dian)泳過程；

在(zai)(zai)電泳(yong)(yong)槽(cao)的(de)(de)內(nei)槽(cao)內(nei)加(jia)入1×Tris-甘氨酸(suan)電泳(yong)(yong)緩沖(chong)(chong)液(ye)(讓電泳(yong)(yong)緩沖(chong)(chong)液(ye)漫過加(jia)樣(yang)孔)，輕(qing)輕(qing)的(de)(de)撥出(chu)梳子，用1ml吸頭徹(che)底沖(chong)(chong)洗(xi)加(jia)樣(yang)孔，隨后在(zai)(zai)電泳(yong)(yong)槽(cao)外槽(cao)加(jia)入適(shi)量(liang)的(de)(de)1×Tris-甘氨酸(suan)電泳(yong)(yong)緩沖(chong)(chong)液(ye)。

表四 Native PAGE電泳條件

三. 染色：

1. 將電泳后的PAGE膠取下(xia)放(fang)入(ru)塑料容器中，加入(ru)適量FastBlue蛋白染色液或(huo)常(chang)規(gui)考馬(ma)斯亮藍染色液（以(yi)剛剛覆(fu)蓋過膠面為(wei)適），條(tiao)帶1-2分鐘(zhong)即可見。

2. 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶清(qing)晰可(ke)見(jian)。

3. 加(jia)入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動(dong)10-15分鐘至背景(jing)干凈(jing)。

四. 實驗示例：