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RealPAGE plus彩色凝膠(jiao)快速制(zhi)備試劑盒

 RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit

●  貨(huo)品規(gui)格：

●  貨(huo)品內容：

● 產(chan)品簡(jian)介：

該產品(pin)利用聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)電(dian)泳原理(li)，采用合(he)理(li)設計的(de)預混(hun)合(he)配方(fang)和配制(zhi)流程，可(ke)在50分鐘內(nei)配制(zhi)得到高質量的(de)聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)，用于變性(xing)和非變性(xing)蛋白(bai)凝膠(jiao)電(dian)泳。本產品(pin)可(ke)以配制(zhi)常用分離(li)膠(jiao)濃(nong)度6%、8%、10%、12%和15%，可(ke)以滿足絕(jue)大(da)多數蛋白(bai)電(dian)泳需求(qiu)。

本試(shi)劑盒大約可(ke)以(yi)(yi)配(pei)制60-125塊(kuai)常規大小(xiao)（8×10cm）PAGE凝(ning)(ning)膠，具體數量根據凝(ning)(ning)膠厚度決定：0.75mm厚度凝(ning)(ning)膠可(ke)以(yi)(yi)配(pei)制125塊(kuai)膠，1mm厚度凝(ning)(ning)膠可(ke)以(yi)(yi)配(pei)制至少90塊(kuai)膠，1.5mm厚度凝(ning)(ning)膠可(ke)以(yi)(yi)配(pei)制至少60塊(kuai)膠。

● 運輸和貯存(cun)：

本產品常溫運(yun)輸；組份按照標(biao)簽溫度貯存；有效(xiao)期一年。

● 特點：

1. 方便：彩色(se)上層(ceng)(ceng)膠(jiao)(jiao)，方便上樣；上層(ceng)(ceng)膠(jiao)(jiao)和下層(ceng)(ceng)膠(jiao)(jiao)溶液1:1混合，無(wu)需計算(suan)；

2. 安(an)全：不(bu)用接觸(chu)有毒(du)粉末；不(bu)用單獨添加(jia)TEMED；

● 使用(yong)說(shuo)明：

一(yi)  凝膠制備：

1.1參照凝膠(jiao)模(mo)具說明(ming)書，裝配好(hao)凝膠(jiao)模(mo)具。

1.2 根據下表參(can)考選擇合適(shi)的(de)凝膠濃度

表一不同濃度的PAGE下層膠的最佳分(fen)離范圍(wei)

1.3 根據(ju)下表配制凝膠：

表(biao)二 凝(ning)膠配制(zhi)表(biao)

1.3.1 取等體積下層膠溶液B 和(he)下層膠溶液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混勻；

1.3.2混合(he)溶液中加入(ru)(ru) 40/50/80 μl的(de)改良型促(cu)凝劑，輕(qing)輕(qing)混勻，將混勻后的(de)溶液注入(ru)(ru)制(zhi)膠玻(bo)璃(li)板(ban)中，使液面和(he)短玻(bo)璃(li)板(ban)上沿之(zhi)間(jian)的(de)距離比梳齒(chi)長0.5 cm即可(ke)；

注(zhu)意：此溶液(ye)為過(guo)量，請勿全(quan)部注(zhu)入。

1.3.3 沿(yan)玻璃板緩慢加(jia)入適量滅菌水(shui)或(huo)無水(shui)乙(yi)醇覆蓋于下層(ceng)膠之上，待下層(ceng)膠凝固后，倒去上層(ceng)水(shui)或(huo)乙(yi)醇；

注意：當水（乙(yi)醇）和膠(jiao)之間有一條折射線時，說明膠(jiao)已凝固(gu)；25℃時5-10分(fen)鐘(zhong)可(ke)以聚合。

1.3.4 取等體積彩色上層膠(jiao)溶(rong)(rong)液B和上層膠(jiao)溶(rong)(rong)液A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混勻；

1.3.5向(xiang)混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改(gai)良型促凝(ning)劑(ji)，輕輕混勻(yun)，插(cha)入梳(shu)齒；

1.3.6 待上層膠(jiao)凝固后 （約20-40 min），拔去梳齒即可用于(yu)電泳(yong)。

注(zhu)：凝膠的聚(ju)(ju)合(he)(he)時(shi)間與環境溫(wen)度有關。夏天溫(wen)度較高(gao)時(shi)，聚(ju)(ju)合(he)(he)較快；冬(dong)天氣溫(wen)低時(shi)，聚(ju)(ju)合(he)(he)時(shi)間會延長。

上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚(ju)合；18℃ 35-40分鐘可以聚(ju)合。

二  電(dian)泳：

2.1 SDS-PAGE變性電(dian)泳：

2.1.1電泳緩沖液配制：

將5×Tris-甘(gan)(gan)氨(an)酸(suan)(suan)-SDS電(dian)泳緩沖(chong)液(ye)干粉（自備，組份0.96 M 甘(gan)(gan)氨(an)酸(suan)(suan)，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒(dao)入1L燒杯(bei)中，加入約(yue)900 ml水徹(che)底溶解，用水定容至1 L，即配成(cheng)5×Tris-甘(gan)(gan)氨(an)酸(suan)(suan)電(dian)泳緩沖(chong)液(ye)（此溶液(ye)不用調節pH值(zhi)）。用前再(zai)稀釋5倍即配成(cheng)1×Tris-甘(gan)(gan)氨(an)酸(suan)(suan)-SDS電(dian)泳緩沖(chong)液(ye)。

2.1.2 樣(yang)品處理：融化(hua)-混合-變性-上樣

5×MonoColor蛋(dan)白(bai)上(shang)(shang)樣(yang)(yang)(yang)緩沖(chong)(chong)(chong)液常(chang)溫數分鐘(zhong)解凍(dong)后輕輕搖勻，以確保溶(rong)液混合均勻；將緩沖(chong)(chong)(chong)液與(yu)蛋(dan)白(bai)樣(yang)(yang)(yang)品按照1：4的(de)比例混勻，如8 μl樣(yang)(yang)(yang)品加(jia)入2 μl 5×上(shang)(shang)樣(yang)(yang)(yang)緩沖(chong)(chong)(chong)液；將蛋(dan)白(bai)樣(yang)(yang)(yang)品置于(yu)95℃中(zhong)加(jia)熱5-10分鐘(zhong)；蛋(dan)白(bai)樣(yang)(yang)(yang)品加(jia)入凝膠(jiao)加(jia)樣(yang)(yang)(yang)孔內電泳。

2.1.3 電(dian)泳過程；

在電(dian)泳(yong)槽的(de)(de)內(nei)槽內(nei)加(jia)入(ru)1×Tris-甘(gan)氨(an)(an)酸(suan)(suan)-SDS電(dian)泳(yong)緩沖(chong)液(讓電(dian)泳(yong)緩沖(chong)液漫(man)過加(jia)樣孔(kong))，輕(qing)輕(qing)的(de)(de)撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖(chong)洗加(jia)樣孔(kong)，隨(sui)后在電(dian)泳(yong)槽外槽加(jia)入(ru)適(shi)量(liang)的(de)(de)1×Tris-甘(gan)氨(an)(an)酸(suan)(suan)-SDS電(dian)泳(yong)緩沖(chong)液。

表三 SDS-PAGE電泳條件

2.2 非(fei)變性電(dian)泳（Native PAGE）：

2.2.1電泳(yong)緩沖(chong)液配制：

將5×Tris-甘氨酸電(dian)泳緩沖液干粉（自(zi)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯(bei)中，加(jia)入約900 ml水徹(che)底溶(rong)解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電(dian)泳緩沖液（此溶(rong)液不用調節(jie)pH值）。用前再稀(xi)釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電(dian)泳緩沖液。

2.2.2 樣品處理：融化-混合-上(shang)樣

5×非(fei)變性(xing)非(fei)還原蛋(dan)白上(shang)樣緩沖液常溫數(shu)分鐘(zhong)解凍后輕(qing)輕(qing)搖(yao)勻，以確(que)保溶(rong)液混合(he)均勻；將緩沖液與蛋(dan)白樣品按(an)照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加(jia)入(ru)2 μl 5×上(shang)樣緩沖液；蛋(dan)白樣品加(jia)入(ru)凝膠加(jia)樣孔內(nei)電泳。注：非(fei)變性(xing)電泳樣品不(bu)能加(jia)熱處理(li)。

2.2.3 電(dian)泳過程；

在(zai)(zai)電泳槽的內槽內加(jia)入1×Tris-甘(gan)氨酸電泳緩沖(chong)液(ye)(讓電泳緩沖(chong)液(ye)漫(man)過加(jia)樣孔(kong))，輕輕的撥出梳子，用(yong)1ml吸(xi)頭徹(che)底沖(chong)洗加(jia)樣孔(kong)，隨(sui)后在(zai)(zai)電泳槽外槽加(jia)入適量的1×Tris-甘(gan)氨酸電泳緩沖(chong)液(ye)。

表四(si) Native PAGE電泳條件

三. 染色：

1. 將(jiang)電泳后(hou)的PAGE膠取下放入(ru)塑料容(rong)器中，加入(ru)適量FastBlue蛋白(bai)染色(se)液(ye)或常規考(kao)馬斯亮藍(lan)染色(se)液(ye)（以剛剛覆蓋(gai)過膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。

2. 搖(yao)床常(chang)溫搖(yao)動10-15分鐘至條帶清晰可見(jian)。

3. 加入適量(liang)蒸(zheng)餾水脫色，期間更換1-2次蒸(zheng)餾水，搖(yao)床常溫搖(yao)動(dong)10-15分鐘至背景干凈。

四(si). 實驗(yan)示例：