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RealPAGE plus彩色凝(ning)膠快速制備試劑盒

 RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit

●  貨品規格：

●  貨品內容：

● 產品簡介：

該產品利用聚(ju)丙烯酰(xian)胺凝(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)電(dian)(dian)泳原理，采用合理設(she)計的預混(hun)合配(pei)(pei)方(fang)和(he)配(pei)(pei)制(zhi)流程，可在(zai)50分鐘內配(pei)(pei)制(zhi)得(de)到高(gao)質量(liang)的聚(ju)丙烯酰(xian)胺凝(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)，用于變性和(he)非變性蛋白凝(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)電(dian)(dian)泳。本(ben)產品可以配(pei)(pei)制(zhi)常用分離膠(jiao)(jiao)(jiao)濃(nong)度6%、8%、10%、12%和(he)15%，可以滿(man)足(zu)絕大多數蛋白電(dian)(dian)泳需(xu)求。

本試(shi)劑盒大約可(ke)以(yi)(yi)配制60-125塊常規大小（8×10cm）PAGE凝膠，具體(ti)數(shu)量(liang)根據凝膠厚(hou)度(du)決定(ding)：0.75mm厚(hou)度(du)凝膠可(ke)以(yi)(yi)配制125塊膠，1mm厚(hou)度(du)凝膠可(ke)以(yi)(yi)配制至少90塊膠，1.5mm厚(hou)度(du)凝膠可(ke)以(yi)(yi)配制至少60塊膠。

● 運輸和(he)貯(zhu)存：

本(ben)產品(pin)常溫運輸；組份按照(zhao)標簽溫度(du)貯存；有效期一(yi)年。

● 特點：

1. 方(fang)便：彩(cai)色(se)上層膠(jiao)，方(fang)便上樣(yang)；上層膠(jiao)和下層膠(jiao)溶(rong)液1:1混(hun)合，無(wu)需計算(suan)；

2. 安全(quan)：不(bu)用接觸有(you)毒(du)粉末；不(bu)用單獨(du)添加TEMED；

● 使用說明(ming)：

一(yi)  凝(ning)膠制備：

1.1參照凝膠模(mo)具說明(ming)書(shu)，裝配好(hao)凝膠模(mo)具。

1.2 根據下表參考(kao)選擇合(he)適(shi)的(de)凝膠濃度

表(biao)一不同濃度的PAGE下層膠的最佳分離(li)范(fan)圍

1.3 根據下(xia)表(biao)配制凝膠：

表二 凝膠(jiao)配制(zhi)表

1.3.1 取等體積(ji)下(xia)(xia)層膠(jiao)溶(rong)液B 和下(xia)(xia)層膠(jiao)溶(rong)液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混(hun)勻；

1.3.2混(hun)合溶(rong)液(ye)中加入 40/50/80 μl的(de)(de)改良型促凝劑，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻(yun)，將(jiang)混(hun)勻(yun)后的(de)(de)溶(rong)液(ye)注入制(zhi)膠(jiao)玻璃板(ban)中，使液(ye)面和短玻璃板(ban)上(shang)沿之間的(de)(de)距離比梳(shu)齒長0.5 cm即可；

注意：此溶(rong)液為過(guo)量，請勿全部注入。

1.3.3 沿(yan)玻璃板緩慢(man)加入適量滅菌水(shui)(shui)或無水(shui)(shui)乙醇覆蓋于下層(ceng)膠之上(shang)，待下層(ceng)膠凝固后，倒去上(shang)層(ceng)水(shui)(shui)或乙醇；

注意：當水（乙醇）和膠(jiao)之(zhi)間有一(yi)條折(zhe)射(she)線時(shi)，說明膠(jiao)已凝(ning)固；25℃時(shi)5-10分(fen)鐘可以聚合。

1.3.4 取等體(ti)積彩色上層膠溶液(ye)B和上層膠溶液(ye)A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混勻；

1.3.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑，輕輕混勻，插入梳齒；

1.3.6 待上層膠凝固后 （約20-40 min），拔去(qu)梳齒(chi)即(ji)可用于電泳。

注：凝膠的聚(ju)(ju)合(he)時間與環境(jing)溫度有(you)關。夏天(tian)溫度較高時，聚(ju)(ju)合(he)較快；冬天(tian)氣溫低時，聚(ju)(ju)合(he)時間會延(yan)長。

上層膠25℃ 20-25分鐘(zhong)可以聚合；18℃ 35-40分鐘(zhong)可以聚合。

二(er)  電泳：

2.1 SDS-PAGE變性電泳：

2.1.1電泳緩沖液(ye)配制：

將5×Tris-甘(gan)氨(an)(an)酸(suan)-SDS電泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)干(gan)粉（自備，組(zu)份0.96 M 甘(gan)氨(an)(an)酸(suan)，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入(ru)1L燒杯中，加入(ru)約900 ml水(shui)徹底(di)溶解，用水(shui)定容至1 L，即(ji)配(pei)成5×Tris-甘(gan)氨(an)(an)酸(suan)電泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)（此溶液(ye)不用調節pH值）。用前(qian)再稀(xi)釋5倍即(ji)配(pei)成1×Tris-甘(gan)氨(an)(an)酸(suan)-SDS電泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)。

2.1.2 樣品處理：融化-混合-變(bian)性(xing)-上(shang)樣

5×MonoColor蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)上樣緩(huan)沖(chong)液(ye)常溫數(shu)分鐘解凍后輕(qing)輕(qing)搖勻(yun)，以(yi)確保溶液(ye)混(hun)合均勻(yun)；將(jiang)緩(huan)沖(chong)液(ye)與蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)樣品按照1：4的(de)比例混(hun)勻(yun)，如(ru)8 μl樣品加(jia)入(ru)2 μl 5×上樣緩(huan)沖(chong)液(ye)；將(jiang)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)樣品置于95℃中加(jia)熱5-10分鐘；蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)樣品加(jia)入(ru)凝膠加(jia)樣孔內電(dian)泳。

2.1.3 電(dian)泳過程；

在(zai)電(dian)(dian)(dian)(dian)泳(yong)槽(cao)的內槽(cao)內加(jia)(jia)入(ru)1×Tris-甘氨酸(suan)-SDS電(dian)(dian)(dian)(dian)泳(yong)緩沖(chong)(chong)液(讓電(dian)(dian)(dian)(dian)泳(yong)緩沖(chong)(chong)液漫(man)過(guo)加(jia)(jia)樣(yang)孔)，輕輕的撥(bo)出梳子(zi)，用1ml吸頭(tou)徹底沖(chong)(chong)洗加(jia)(jia)樣(yang)孔，隨后在(zai)電(dian)(dian)(dian)(dian)泳(yong)槽(cao)外槽(cao)加(jia)(jia)入(ru)適(shi)量的1×Tris-甘氨酸(suan)-SDS電(dian)(dian)(dian)(dian)泳(yong)緩沖(chong)(chong)液。

表三(san) SDS-PAGE電泳條件

2.2 非變性(xing)電泳（Native PAGE）：

2.2.1電泳(yong)緩沖液(ye)配制：

將5×Tris-甘(gan)氨酸電泳(yong)緩(huan)沖液(ye)干粉（自備，組份0.96 M 甘(gan)氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底(di)溶(rong)解(jie)，用(yong)(yong)(yong)水定(ding)容至(zhi)1 L，即(ji)配成(cheng)(cheng)5×Tris-甘(gan)氨酸電泳(yong)緩(huan)沖液(ye)（此溶(rong)液(ye)不用(yong)(yong)(yong)調節(jie)pH值）。用(yong)(yong)(yong)前再稀釋5倍即(ji)配成(cheng)(cheng)1×Tris-甘(gan)氨酸-SDS電泳(yong)緩(huan)沖液(ye)。

2.2.2 樣(yang)品處理：融化-混合-上樣(yang)

5×非變(bian)(bian)性(xing)非還原(yuan)蛋白(bai)上(shang)樣(yang)(yang)緩沖液(ye)常溫數(shu)分鐘解(jie)凍(dong)后輕輕搖勻，以確保溶液(ye)混合均勻；將緩沖液(ye)與蛋白(bai)樣(yang)(yang)品按照1：4的(de)比例混勻，如8 μl樣(yang)(yang)品加(jia)入(ru)2 μl 5×上(shang)樣(yang)(yang)緩沖液(ye)；蛋白(bai)樣(yang)(yang)品加(jia)入(ru)凝膠(jiao)加(jia)樣(yang)(yang)孔(kong)內電泳(yong)。注(zhu)：非變(bian)(bian)性(xing)電泳(yong)樣(yang)(yang)品不能加(jia)熱處(chu)理。

2.2.3 電泳過程；

在電泳(yong)槽的內槽內加(jia)(jia)入(ru)1×Tris-甘氨(an)酸電泳(yong)緩(huan)沖液(ye)(讓(rang)電泳(yong)緩(huan)沖液(ye)漫過加(jia)(jia)樣孔)，輕(qing)輕(qing)的撥出梳(shu)子，用1ml吸頭徹底沖洗(xi)加(jia)(jia)樣孔，隨后在電泳(yong)槽外槽加(jia)(jia)入(ru)適量的1×Tris-甘氨(an)酸電泳(yong)緩(huan)沖液(ye)。

表四 Native PAGE電泳條件

三. 染色(se)：

1. 將電泳后(hou)的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量(liang)FastBlue蛋(dan)白(bai)染色(se)液或常規(gui)考馬斯亮藍染色(se)液（以(yi)剛剛覆蓋過膠面為(wei)適），條帶1-2分鐘即可(ke)見。

2. 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶清晰可(ke)見。

3. 加入適量蒸餾(liu)水(shui)脫色，期(qi)間(jian)更換(huan)1-2次(ci)蒸餾(liu)水(shui)，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。

四. 實驗示例：